隨著城市污水處理廠的污水處理量逐年增加，污泥產量亦隨之攀升，預計至2025年，我國剩余污泥年產量將達到9×107t(80%含水率)。污泥資源化利用已成為城市污水處理廠低碳發展的重要內容。污泥中有機物含量約占總固體的50%~70%，主要為蛋白質、碳水化合物和脂質等，且含有有機污染物和病原菌等。好氧發酵是一種常見污泥處理技術，通過微生物的代謝作用促進有機物的分解轉化產生高質量的腐熟產物，可在實現污泥的無害化處理的同時實現污泥有機質資源化利用。
污泥好氧發酵過程主要包括礦化過程和腐殖化過程，微生物可將基質中不穩定的有機化合物(例如碳水化合物、蛋白質和脂肪等)轉化為穩定的腐殖酸(humicsubstances，HS)，包括富里酸(fulvicacids，FA)和胡敏酸(humicacids，HA)。腐殖化過程產生的腐殖質具有促進植物生長、減少植物病害并增加土壤固碳的作用。促進腐殖化過程已然成為提升好氧發酵處理效果的重要手段。多酚-蛋白質、多酚自縮合和木質素蛋白質理論等多種途徑被用于描述自然界的腐殖化過程，而上述途徑可能并存于好氧發酵過程。已有研究指出，腐殖酸前體物的形成和聚合受污泥和園林廢棄物進料比例的影響(如蛋白質和纖維素等)。同時，提高原料中污泥比例亦可提升養分含量，從而強化菌群之間的相互作用，進而加速礦化和腐殖化過程。好氧發酵過程中的有機物礦化過程主要以產熱為主，而高溫會促進難降解有機質(如纖維素等)的分解為腐殖化過程提供前體物。蛋白質作為污泥好氧發酵升溫及高溫階段的主要產熱來源，研究其分解調控策略對延長高溫持續時間以強化腐殖化過程具有重要意義。
本研究旨在闡明污泥好氧發酵過程中升溫階段的蛋白質分解特性，分析蛋白質分解對好氧發酵升溫過程的貢獻，并探討污泥在好氧發酵過程中蛋白質分解調控策略；通過全周期試驗探究調控前后污泥好氧發酵過程中理化性質、腐殖化過程及微生物群落的變化差異，為污泥好氧發酵技術的工程應用提供理論支撐。
1、材料與方法
1.1 實驗原料
試驗污泥取自西安市某污水處理廠的脫水污泥(由剩余污泥和初沉污泥組成)。木屑采購于某木材加工廠，粒徑小于5mm，作為污泥好氧發酵的調理劑，用于調節堆體的含水率和碳氮比(C/N)。腐熟堆肥作為微生物返混料，取自陜西省漢中市某污水處理廠，包含酵母菌、乳酸菌等。原料的基本理化性質見表1。
1.2實驗裝置
污泥好氧發酵裝置主要由好氧發酵箱、控溫裝置和曝氣系統組成(圖1)。好氧發酵箱是由不銹鋼制成的正方體加蓋箱體，且設有進出氣孔，有效容積為27L；控溫裝置為恒溫培養箱，可通過調節恒溫培養箱溫度改變好氧發酵箱外部環境溫度；曝氣裝置由氣體流量計和曝氣泵組成，通過好氧發酵箱底部布氣板實現均勻曝氣；出氣管連接臭氣處理裝置。
1.3 實驗方法
本試驗分為2部分：第一部分為探究升溫階段不同溫度條件對蛋白質分解的影響而進行的批次實驗。按照10∶3∶3的濕基比例(參照陜西環保集團有機固廢處置中心的污泥好氧發酵工程運行參數)將污泥、木屑和腐熟堆肥混合均勻，初始含水率為60%~65%，曝氣量為1.5L·min−1，總質量為8kg。為得到不同溫度條件下的蛋白質降解速率，通過調控環境溫度形成不同的升溫曲線，據此分為A~D，4組實驗(A組的環境溫度與堆體溫度相差0~2℃；B組的環境溫度比堆體溫度低2~4℃；C組的環境溫度比堆體溫度低4~6℃；D組的環境溫度比堆體溫度低6~8℃)。第二部分為探究調控后的條件對好氧發酵過程的影響而進行的全周期試驗。將污泥、木屑和腐熟堆肥以初始濕基比例10∶3∶3混合均勻后作為對照組，經第一部分實驗結果得出的濕基比例13∶3∶3作為調控組。總質量為8kg，曝氣量為1.5L·min−1，調整環境溫度比堆體溫度低1.5℃。堆體溫度≥70℃時或每隔3d翻堆1次，好氧發酵時間共計35d。翻堆完成后在堆體頂部、中部和底部取樣并混合均勻。
1.4 分析方法
溫度采用電子溫度計于每天上午、下午和晚上記錄3次，取平均值；含水率和有機質含量測定采用重量法(CJ/T221-2005)；將鮮樣與去離子水按1∶10進行混合，放入25℃水浴搖床180r·min−1振蕩2h，過0.45μm濾膜，使用pH計(PHS-3C，上海精科儀器有限公司)測定pH值；蛋白質采用改良Lowry法測定；總有機碳用重鉻酸鉀氧化-分光光度法測定(HJ615-2011)；總氮用硫酸-過氧化氫消解，取部分消解液稀釋后用凱氏定氮儀滴定。
積溫T：堆體的累計溫度可作為判定好氧發酵穩定化的指標。積溫方程如式(1)所示。
式中：Ti為i時刻的堆體溫度，℃；T0為好氧發酵微生物大量繁殖時的起始溫度，參考陳同斌等研究取值15℃；Δt為單位時間，h。
腐殖質的提取和測定：取風干粉碎過100目篩的樣品1g，加入0.1mol·L−1NaOH和0.1mol·L−1Na2P2O7的混合液(1∶1，v/v)30mL攪拌均勻，在70℃恒溫水浴振蕩器上提取1h，3500r·min−1離心15min，用0.45μm濾膜過濾，重復多次至上清液無色，將濾液混合后即為腐殖酸溶液。吸取部分腐殖酸溶液，用0.5mol·L−1的H2SO4溶液將其pH調至1.0~1.5，靜置過夜，次日在10000r·min−1條件下離心10min，上清液即為富里酸。用0.05mol·L−1的NaOH將沉淀溶解后即為胡敏酸。腐殖酸、胡敏酸和富里酸含量通過重鉻酸鉀氧化-分光光度法進行測定。
細菌群落分析：污泥好氧發酵樣品按照E.Z.N.A.®soilDNAKit(MJYH，上海美吉逾華生物醫藥科技有限公司)說明書抽提DNA，然后對16S的V3-V4區域(引物序列338F：5'-ACTCCTAGGGGAGGCAGCAG-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTATAAT-3')進行PCR擴增，利用IlluminaPE250平臺進行測序，在美吉生物云平臺進行分析。
2、結果與討論
2.1 升溫階段的溫度和蛋白質含量變化
好氧發酵過程中，維持適宜的溫度對于增強微生物活性和提高有機質降解速率至關重要。在不同的環境溫度條件下4個處理組的升溫曲線具有明顯差異(如圖2(a))。從環境溫度和堆體溫度變化曲線可以看出，A、B、C、D，4個實驗組升溫階段持續時間(堆體溫度上升至50℃所需的時間)分別為27.0、40.0、10.5、69.5h。從環境溫度和堆體溫度變化曲線可以看出，B和D組升溫階段持續時間較長，主要是因為環境溫度明顯要低于其他兩組。總蛋白質的含量呈現明顯下降趨勢(圖2(b))。升溫階段的蛋白質降解率隨升溫階段持續時間的延長而增加，分別為12.31%、36.52%、23.53%和66.06%。D組的蛋白質降解率最高，可能是其初始蛋白質濃度較高，具有較高的初始降解速率。這與WANG等的研究一致，即可溶性底物的初始濃度較高可能導致更快的降解速率。
2.2 升溫階段數據擬合分析
目前，對好氧發酵中有機質降解進行數據擬合的動力學模型主要有：一階動力學模型、Monod模型和經驗模型。其中，一級動力學模型建立需要的參數較少，模型求解簡單，擬合分析效果相對較好。通過對升溫階段的總蛋白質濃度變化進行分析得出，升溫階段的可降解蛋白質濃度與升溫階段持續時間和初始蛋白質濃度呈線性關系(式(2))，對3者進行線性擬合得出k=0.0168(R2=0.912)。
式中：C為可降解蛋白質濃度，mg·g−1干物質；t為升溫階段持續時間(T<50℃)，h；C0為初始蛋白質濃度，mg·g−1干物質。
根據一階動力學方程可計算得到升溫階段的可降解蛋白質含量變化(式(3))。
式中：C為污泥好氧發酵t時刻的可降解蛋白質濃度，g·g−1干物質；k為降解速率常數，h−1；kT為溫度對可降解蛋白質降解速率的修正系數。
反應速率受到溫度、含水率和pH等條件的影響，其中溫度對反應速率的影響最為顯著，而在升溫階段中含水率和pH等條件變化不大。因此，本研究將溫度作為反應速率的主要影響因素，溫度對可降解蛋白質降解速率的修正系數kT由式(4)計算。
式中：x為溫度系數；T為堆體溫度。
將式(4)帶入到式(3)中，并選取批次實驗中得到的可降解蛋白質濃度及對應的時間(圖3)，帶入公式中用Matlab進行擬合得出降解速率常數k為0.1114，溫度系數x為0.9530。在已有研究中，很少有關于好氧發酵過程中蛋白質降解的動力學數據，但大多數關于有機質降解動力學的研究均表明有機質的降解遵循一階動力學。有機質可以簡單的分為可降解部分和不可降解部分。例如，TREMIER等的好氧發酵模型將基質分為可直接生物降解、可水解和惰性部分。還有研究提出了更為復雜的分類方法，如將基質分成碳水化合物、脂類、蛋白質、半纖維素、木質素，有時還分成特定的化學種類，以及以生物或化學需氧量分類。因此，在此基礎上可以假設蛋白質的降解是符合一階動力學的。本研究中的數據擬合與輔料、污泥品質及實驗條件等影響因素有關。
污泥好氧發酵系統的熱量平衡可以表達為Q積累=Q輸入-Q輸出+Q產生，上述方程是好氧發酵過程能量平衡模擬的理論基礎。本研究的熱量平衡計算基于可降解蛋白質含量的變化，考慮到蛋白質分解并不是完全氧化的過程，所以對熱量平衡方程進行一定的修正。在此基礎上建立的好氧發酵熱量平衡擬合分析公式見式(5)和式(6)。
式中：m為堆體質量，kg；c堆體為堆體的比熱容，kJ·(kg·℃)−1；Qi為堆體殘留熱量，kJ；G為進出口空氣流量，kg·h−1；c空氣為空氣比熱容，kJ·(kg·℃)−1，取1.0044；H為蛋白質降解產熱量，kJ·kg−1，取20458.5；a為熱量輸入修正系數；b為熱量輸出修正系數；c為蛋白質降解產熱修正系數。
通過Nash-Sutcliffe系數(nash-sutcliffeefficiency，NSE)對數據擬合分析結果的準確度進行表征，當a、b和c分別取0.15、11和0.2時，升溫曲線和可降解蛋白質的試驗值與擬合效果吻合最優(圖3(a)和3(b)所示)。4組實驗的溫度曲線擬合結果的NSE值為0.19~0.82；可降解蛋白質擬合結果的NSE值0.72~0.92。擬合結果的NSE值均大于0，因此認為擬合結果準確度可信。
2.3 不同條件下的升溫速率及蛋白質殘留率變化
在污泥好氧發酵過程中，升溫階段的蛋白質等易降解有機物分解產生熱量使堆體升溫進入到高溫階段。而腐殖質的形成則需要好氧發酵過程不同階段的有機物分解產物作為前體物質，所以在升溫階段結束時較高的有機質殘留會促進腐殖質的形成。
基于好氧發酵升溫階段的可降解蛋白質降解情況和熱量平衡的數據擬合結果對不同的可降解蛋白質濃度(0.030~0.046g·g−1干物質)和不同的散熱條件(調整環境溫度比堆體的溫度低0.5~3.0℃)進行計算，得出升溫階段不同條件下的升溫速率及蛋白質殘留率，如圖4(a)和4(b)所示。升溫速率和蛋白質殘留率均與溫差呈負相關，與可降解蛋白質濃度呈正相關。好氧發酵初期，污泥中的初始蛋白質含量的升高會為堆體提供更多的熱量，將有利于提高升溫速率，進而縮短升溫階段的持續時間。為縮短升溫階段時間，可通過改變污泥質量占比達到增加蛋白質濃度的目的，但同時也需要考慮含水率(60%~70%)、碳氮比(20~30∶1)等影響因素。MASON等探究了小試規模升溫調控反應器堆肥、恒溫調控的反應器堆肥與自然堆肥的差異，反應器式堆肥存在散熱量大的問題，與實際工程堆肥存在較大差異，為更好的模擬好氧發酵工藝，可采用升溫調控的方式，通常采用溫差為1~2℃的條件。含水率高于70%會形成厭氧環境，不利于好氧發酵過程的進行。因此，后續研究將采用環境溫度比堆體溫度低1.5℃的溫度條件、污泥質量占比為68%(含水率70%左右)的條件進行全周期試驗。
2.4 理化性質的變化
全周期好氧發酵過程中理化性質的變化如圖5所示。溫度能夠反映出好氧發酵過程中的微生物活性，同樣也可作為判斷堆體是否滿足無害化標準的間接指標。由圖5(a)可知，對照組和調控組的溫度均在第2d達到峰值，分別為60.15和65.15℃，高溫階段(≥50℃)分別持續6和10d，滿足無害化標準。事實上，污泥質量占比的增加提供了更多的易降解有機物，這是調控組升溫速度快、高溫持續時間長的主要原因。以15℃對2組的有效積溫進行計算，對照組的有效積溫為1.77×104℃·h，調控組的有效積溫為2.03×104℃·h，調控組的積溫相較對照組高出14.39%，表明適當的調控污泥質量占比可縮短污泥好氧發酵周期。
含水率會影響氧氣的傳遞和微生物的活性，同時可以調控堆體溫度，是影響污泥好氧發酵過程的主要因素之一。對照組和調控組的初始含水率分別為63.43%和69.05%(圖5(b))。較高含水率有利于小分子有機物于好氧發酵體系內傳遞，促進微生物對有機物的利用，從而促進污泥好氧發酵過程。由于堆體溫度的變化各組含水率均呈現下降趨勢。在經過35d的好氧發酵后，對照組和調控組的含水率分別為47.36%和45.89%，水分去除率分別為25.34%和33.54%。調控組的水分去除率高于對照組，說明適當提高污泥質量占比所帶來的熱量可促進堆體的減量化效果。
2個處理組的pH值變化規律基本一致(圖5(c))。在好氧發酵初期，小分子有機酸積累導致pH值有所下降。進入高溫階段后，2組的pH值均快速增加至8.5以上，呈弱堿性，這主要是由于此階段中大量含氮有機物分解導致的。值得注意的是高溫和高pH值的環境會促進NH4+-N以氨氣的形式散逸至大氣中，造成環境污染。隨著氨氣的揮發及硝化作用的加強，兩組的pH值逐漸下降至7.5左右。在整個好氧發酵過程中，調控組的pH值略高于對照組，這可能緣于污泥質量占比變化造成調控組中由含氮有機物分解產生的NH4+-N增加。
2.5 腐殖化效果分析
腐殖化過程反映了微生物分解代謝和合成代謝之間的平衡，這主要受到污泥好氧發酵的環境和前體物的影響。HS和HA濃度在好氧發酵初期有明顯的下降趨勢，然后逐漸升高(圖6(a)和6(b))，而FA呈下降趨勢(圖6(c))。污泥中有機物分解轉化為HS前體物，形成不穩定的HS，而在高溫階段不穩定的HS可在部分微生物的代謝作用下被分解。在進入降溫及腐熟階段后，2組的HS含量逐漸上升且調控組的HS含量明顯高于對照組，最終調控組的HS含量高出對照組8.76%。
經過35d的好氧發酵后，對照組和調控組中HA濃度分別由24.69和23.24g·kg−1增加到28.88和36.56g·kg−1，相比于初始值上升16.97%和57.31%。調控組的HA含量要高出對照組26.59%，這可能是調控組中污泥含量較高，而污泥所含蛋白質等有機物可為HA形成提供前體物所致，這與ZHANG等的研究結果一致。與HA相比，FA作為不穩定的腐殖質組分，可被微生物直接利用。在好氧發酵過程中，腐殖質會向更穩定狀態進行轉化，且有研究表明FA可以聚合成更穩定的HA。對照組和調控組的FA濃度分別下降7.05%和21.53%，這可能是因為污泥質量占比的改變延長了高溫持續時間，促進了纖維素等難降解物質的分解，進而促進了FA向HA的轉化。HA/FA可反映堆體的腐殖化程度，結果見圖6(d)。對照組和調控組的HA/FA分別由初始的0.56和0.49上升至0.7和0.97。在第35d時，調控組的HA/FA比值要比對照組高出38.57%，表明調控組的腐殖化效果明顯優于對照組。綜上所述，提高污泥質量占比以調控好氧發酵升溫階段蛋白質降解可以促進腐殖化過程，同時有利于有機碳的穩定化。
2.6 細菌群落的變化
采用PCoA方法分析了污泥好氧發酵過程中門水平中細菌群落的差異性(圖7)。PCoA的PC1和PC2軸分別解釋了細菌群落結構差異的55.61%和23.13%。細菌群落結構從開始階段(第0d)到高溫階段(第3d)，再到腐熟階段(35d)差異顯著。此外，污泥質量占比的改變也顯著影響細菌群落的演替，從而影響好氧發酵性能。
在門的水平上對細菌群落組成進一步分析表明，優勢菌門分別為Firmicutes、Actinobacteriota、Chloroflexi、Proteobacteria、Planctomycetes、Bacteroidota、Gemmatimon-adota、Acidobacteriota及Patescibacteria，相對豐度總和達到80%以上(圖7)。隨著溫度的升高，Firmicutes和Actinobacteriota的相對豐度總和達到75%以上，這是由于它們具有較強的耐熱性，并且它們能夠將木質纖維素等難降解物質分解為生成HA的前體物，從而促進腐殖化過程。此外，有研究表明Actinobacteriota的菌絲能夠破壞細胞壁的木質素結構。Bacteroidota和Proteobacteria可將大分子化合物(如纖維素)分解為小分子前體物，從而促進腐殖化過程，但因其對抑制生命活動的溫度較為敏感，所以其相對豐度呈現先下降而后上升的趨勢。在污泥好氧發酵后期，調控組中Bacteroidota和Proteobacteria的相對豐度相對于對照組有明顯，分別由2.13%和4.60%增加至8.67%和18.02%。因此，兩個處理組的腐殖酸含量在好氧發酵后期都有所回升，且調控組的腐殖酸含量上升幅度更大。
在屬水平上，相對豐度前20的細菌變化如圖8所示。在好氧發酵初期，對照組和調控組主要菌屬均為norank_c_KD4-96、Propioniciclava、Microtrichales和Saprospiraceae，并無明顯差異，但是由于原料占比的改變導致相對豐度有所不同。在進入高溫階段后(第3d)，Brevibacillus、Thermobispora、Bacillus和Symbiobacterium相對豐度增高，相對豐度總和到達40%以上。對照組中Brevibacillus的相對豐度逐漸增加，可能是因為該環境中有機質含量高有利于它的生長。而調控組因高溫階段的延長使得有機質減少，導致Brevibacillus的生長受限，因此其相對豐度下降。Bacillus可在高溫環境下有效地降解木質纖維素，而調控組高溫時間的延長會進一步加強其對木質纖維素的降解。隨著好氧發酵的進行，對照組和調控組的Bacillus的相對豐度均呈現增加趨勢，有利于污泥好氧發酵的穩定化。Ureibacillus可利用可溶性有機物，同時產生胞外水解酶，分解纖維素等難降解有機物為腐殖化過程提供前體物。在第35d，Ureibacillus在調控組中相對豐度為4.43%，而在對照組中僅為1.14%，說明污泥質量占比的增加可能利于Ureibacillus的生長。污泥質量占比的增加不僅延長高溫的持續時間，還使Bacillus等菌屬的活性增強，從而加強好氧發酵后期的腐殖化過程。
基于腐熟度指標及屬水平的細菌群落進行了RDA分析，結果如圖9所示。由圖可知，RDA前2個排序軸可以解釋細菌群落信息的79.94%。在環境因子中，含水率、pH、T、HA及FA對堆體中細菌的群落組成影響較大，其中T和pH對細菌群落相關性最高。根據堆體的環境因子、腐熟指標及細菌群落的分散情況可知：Symbiobacterium、Ureibacillus和Thermobispora與T、pH相關性較強，norank_c_KD4-96與含水率相關性較強，Saprospiraceae與FA相關性較強，Niabella、Roseiflexaceae與HA相關性較強。對照組和調控組可分為3個階段，在升溫階段與Saprospiraceae等相關性較強；調控組和對照組在高溫階段的菌群相似度較高與Symbiobacterium和Thermobispora等嗜熱菌相關性較強；調控組在腐熟階段Niabella等及HA相關度較高。RDA分析進一步說明，本試驗中污泥好氧發酵過程中群落演替存在不同階段，升溫階段Saprospiraceae等會促進易降解有機物分解，有利與堆體快速升溫；高溫階段Symbiobacterium和Thermobispora會加速有機質的降解；腐熟階段Niabella等會對難降解有機物進行分解，促進FA向HA的轉化。調控組在好氧發酵前期提高了蛋白質等有機物的含量，堆體快速升溫，從而延長了高溫持續時間，同時促進了高溫階段至腐熟階段的過度及相應菌群的演替。
3、結論
1)對污泥好氧發酵升溫階段蛋白質降解特性進行分析，升溫階段污泥中的可降解蛋白質含量可通過初始蛋白質濃度和升溫階段持續時間進行擬合分析。將污泥質量占比從62%調整至68%來增加初始蛋白質的含量，以縮短升溫階段所需時間和和提高蛋白質殘留率。
2)全周期試驗表明，通過對升溫階段蛋白質降解進行調控，有效積溫高于對照組14.39%，好氧發酵結束時調控組的HA含量相較于初始含量提高了57.31%，高出對照組26.59%，腐殖質聚合程度(HA/FA)比對照組提高38.57%。提高初始蛋白質含量可以縮短污泥好氧發酵周期，促進腐殖化過程且有利于有機碳的穩定化。
3)通過對污泥好氧發酵過程中蛋白質降解進行調控，污泥質量占比的改變有利于好氧發酵后期富集Bacteroidota和Proteobacteria等具有纖維素降解功能的細菌，其相對豐度相較于對照組提升了3倍，促進了HA的合成，提高腐殖化程度。高溫階段的延長有利于Bacillus等嗜熱菌群，加速對纖維素的分解，進而促進腐熟細菌的生長和腐殖酸的生成。（來源：東北大學資源與土木工程學院，東北大學秦皇島分校資源與材料學院，河北農業大學海洋學院，承德市環保科技發展中心）
