厭氧氨氧化（Anammox）能夠在無需外加碳源的條件下實現高效自養脫氮，適用于低碳氮比城鎮污水處理。但厭氧氨氧化細菌（AnAOB）世代周期長、生長速率低，倍增時間為10~30d，對環境條件要求嚴苛，且只有菌種細胞密度高達1010個/mL以上時才能顯現活性，因此其富集啟動十分緩慢，這限制了該工藝的大規模應用。此外，AnAOB主要以顆粒污泥形式存在，在面對污水水質與水量沖擊時會出現顆粒污泥結構松散、破碎等問題。因此，尋找能夠使系統AnAOB快速富集與穩定運行，同時有效維持其生物量的啟動方法，對Anammox技術在實際工程中的推廣應用具有重要意義。
筆者將Anammox與膜生物反應器（MBR）耦合，構建Anammox-MBR系統，利用MBR的高效截留作用，建立AnAOB顆粒污泥與生物膜復合富集體系；探究在啟動與穩定運行階段梯度提高進水基質濃度與縮短水力停留時間（HRT）等方式對反應器污染物去除特性及AnAOB富集的影響；利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察顆粒污泥形態特征，并通過關鍵酶活性變化和微生物群落結構解析其反應機理，為工程應用中AnAOB快速富集、系統啟動與長期穩定運行提供理論指導。
1、材料與方法
1.1 試驗裝置與接種污泥
Anammox-MBR為不銹鋼圓柱體，有效體積為176.6L，設有溢流口控制反應器液位，內置加熱棒和在線監測儀，試驗裝置如圖1所示。進水自反應器底部由泵泵入，出水經平板膜組件由泵抽出。接種污泥取自南京某污水處理廠UCT（UniversityofCapeTown）工藝生化池厭氧段，污泥濃度約為3500mg/L。
1.2 試驗水質與運行條件
試驗采用連續進水方式，以模擬廢水為進水。NH4+-N和NO2--N分別由NH4Cl和NaNO2提供，基質濃度比例為1∶1。無機碳源、緩沖劑、微量元素等成分的組成及濃度參照文獻設置。
試驗共分為3個階段，啟動期（階段Ⅰ），通過攪拌耦合MBR的截留作用，對菌種進行篩選并富集AnAOB；穩定運行期（階段Ⅱ和階段Ⅲ），停止攪拌，便于形成顆粒污泥。反應器啟動期，為使污泥快速適應環境，采用較長HRT和低進水基質濃度；反應器穩定運行期，為促使菌種快速富集，提高其脫氮和抗沖擊負荷能力，通過階梯式循序提高進水基質濃度（階段Ⅱ）和縮短HRT（階段Ⅲ）的方式提高進水負荷。整個運行階段，反應器水溫通過加熱棒控制為（32.1±1.6）℃，pH=7.40~8.75，各階段運行條件如表1所示。
1.3 分析項目與方法
1.3.1 常規指標分析測試方法
TN、COD、NH4+-N、NO3--N、NO2--N、MLSS、MLVSS等參考《水和廢水監測分析方法》（第4版）進行檢測；pH、溶解氧和溫度采用PHG-217C在線監測儀進行檢測。
1.3.2 污泥形態表征
取反應器穩定運行第460天的MBR膜表面污泥和系統內顆粒污泥，采用SEM觀察分析表面微觀形態與結構特征。
1.3.3 關鍵酶活性測定與微生物群落結構分析
分別取反應器啟動初期（第0天）、啟動成功（第135天）和各階段穩定運行期（第292天和第480天）的膜表面污泥和顆粒污泥，對亞硝酸還原酶（NIR）、肼脫氫酶（HDH）、聯氨合成酶（HZS）及脫氫酶（DHA）進行檢測，按照檢測試劑盒標準方法（ZCIBIO，中國）進行測定；采用CTAB或SDS法對樣本的基因組DNA進行提取，以帶Barcode的特異引物，使用IlluminaNovaSeq6000進行上機測序，測定樣品的微生物群落結構。
2、結果與分析
2.1 Anammox-MBR快速啟動和運行特征
Anammox-MBR中試系統啟動和穩定運行各階段的氮素轉化與去除情況如圖2所示。45~76d與213~255d因疫情防控需要停止進水，324~338d與380~404d因加熱棒故障，水溫分別為20.6~25.6℃與12.4~15.9℃。其中TN容積去除負荷（NRR）、TN進水負荷（NLR）、TN去除率（NRE）用于表征TN的去除情況。
2.1.1 啟動期（階段Ⅰ）
由圖2可知，經過約135d，Anammox-MBR成功啟動，且可分為活性遲滯期、活性展現期和活性提升期3個時期。1~21d，反應器為活性遲滯期，該階段出水各項指標呈現明顯波動，出水NO3--N濃度較低且無明顯變化，表明此時反應器中沒有發生厭氧氨氧化反應。21~94d，反應器內NH4+-N與NO2--N去除率開始同步上升，同時NO3--N生成量呈升高趨勢，表明反應器開始出現厭氧氨氧化反應。但出水NO3--N濃度為（12.83±4.80）mg/L，高于Anammox反應中的理論值（5.09±2.43）mg/L，分析認為是由于進水DO偏高，NH4+-N與NO2--N通過硝化反應生成NO3--N。因此，第95天開始，進水投加Na2SO3進行化學除氧，控制DO<0.2mg/L，與此同時，提高進水氮負荷以促進AnAOB快速富集增殖。受進水氮負荷突升的影響，NH4+-N和NO2--N去除率在95~104d均呈現短暫下降趨勢，分別由33.74%和45.91%降至19.57%和41.82%。當AnAOB逐漸適應后，Anammox活性恢復，反應器性能呈現快速提高趨勢并在短時間內達到穩定，說明進水基質濃度提升加速了菌種的生長和富集。活性提升期末，NH4+-N和NO2--N去除率分別達到（94.16±3.98）%和（94.43±2.72）%，出水NO3--N隨著Anammox活性增強接近理論值，NRE穩定在（80.08±0.80）%，因此認為Anammox-MBR反應器啟動成功。既有研究表明，AnAOB富集培養通常需200~300d，本研究的啟動時間較之大大縮短。這可能是因為，在啟動階段采用厭氧攪拌與MBR耦合的方式預篩選菌種，一方面，反應器內微生物通過攪拌與底物充分接觸，污泥在剪切力作用下以絮狀為主，避免形成包裹大量雜菌的顆粒，導致難以篩除；另一方面，MBR可以防止世代周期較長的AnAOB流失。Tao等發現使用MBR替代SBR啟動Anammox，能將Anammox活性提高19倍，進一步說明了MBR可以更好地富集AnAOB，與本研究結論一致。
2.1.2 穩定運行期（階段Ⅱ和Ⅲ）
反應器啟動成功后，階段Ⅱ（136~292d）通過階梯式提高進水基質濃度進一步富集AnAOB。階段Ⅱ-1，反應器穩定運行，進水NH4+-N和NO2--N濃度為（60.88±6.86）和（62.28±2.52）mg/L，NH4+-N、NO2--N去除率分別達到（95.61±2.48）%和（92.17±2.11）%；NO3--N出水濃度相較于理論值不斷降低，表明反應器內Anammox活性提升的同時，存在其他脫氮途徑消耗NO3--N，考慮到反應器長期缺乏外源有機物，推測可能發生內源反硝化脫氮。在階段Ⅱ-2，將進水NH4+-N和NO2--N濃度提升至（76.35±5.07）和（85.31±3.50）mg/L，此時系統對NH4+-N和NO2--N的去除效果有所下降（p<0.05），平均去除率分別降至（87.46±5.56）%和（88.24±4.52）%；與此同時，出水NO3--N濃度由17.77mg/L降至14.69mg/L，說明反硝化作用增強，有利于Anammox反應產生的NO3--N通過反硝化去除。階段Ⅱ-3，由于進水NH4+-N和NO2--N濃度分別提升至（114.01±4.60）和（114.30±6.23）mg/L，且反應器經過了一段時期的無進水饑餓運行，NH4+-N和NO2--N去除率較低，經過18d的連續運行，反應器性能逐漸恢復，NH4+-N和NO2--N去除率最終分別穩定在（85.09±1.68）%和（86.33±1.42）%，與階段Ⅱ-2無顯著差異；出水NO3--N濃度穩定在（16.74±3.89）mg/L，低于理論計算值，說明反應器內存在穩定的協同脫氮途徑。進一步分析發現，通過階梯式提高進水基質濃度促進Anammox反應的同時，系統中產生的NO3--N濃度也相應升高，且始終低于理論出水濃度，反硝化作用增強，NH4+-N和NO2--N去除率略有下降并逐漸趨于穩定；但由于進水基質濃度提升，總體上Anammox的污染物去除負荷和去除能力均得到顯著提升，AnAOB活性也相應不斷增強。
反應器運行階段Ⅲ（293~480d），在進水基質濃度基本不變的情況下階梯式縮短HRT，提高進水氮負荷，進一步富集純度更高的AnAOB顆粒污泥。根據反應器HRT梯度，可將其劃分為3個時期。此階段存在兩段低溫期，在低溫期內NH4+-N和NO2--N去除率有所下降，但當溫度回升后反應器能迅速從低溫抑制中恢復，說明低溫條件下Anammox仍保留部分活性，系統具有較強的抗沖擊能力。不同HRT下穩定運行時NH4+-N和NO2--N的平均去除率與容積去除負荷如圖3所示。
由圖3可知，隨著HRT縮短，NH4+-N和NO2--N去除率沒有顯著性差異（p>0.05），但容積去除負荷顯著增加（p<0.05）。與HRT=12h相比，當HRT為8和4h時，NH4+-N容積去除負荷分別增加了52.60%和210.87%，而NO2--N容積去除負荷分別增加了51.40%和207.52%，TN的NRR最高可達1.36kg/（m3·d）。可見，Anammox-MBR顯著提高了系統的脫氮能力，NRR高于普通硝化-反硝化工藝。分析認為，一方面，縮短HRT使反應器內上升流速增大，不僅可以有效促進污泥顆粒化、篩選出活性更強的菌種，而且加速了系統內部的物質傳遞過程、促進生物反應；另一方面，MBR使得系統在HRT縮短的同時仍可有效截留世代周期較長的AnAOB，進一步保障了脫氮效率。
2.2 化學計量比分析
Anammox化學反應方程式如下：
NH4+-N和NO2--N同時被去除并生成一定比例的NO3--N，理論計量比為R（1ΔNO2--N∶ΔNH4+-N）=1.32、R（2ΔNO3--N∶ΔNO2--N）=0.20。因此，NH4+-N、NO2--N以及NO3--N三者之間的實測值與理論值對比可表征Anammox-MBR系統中厭氧氨氧化反應進展情況，結果如圖4所示。
裝置啟動初期（階段Ⅰ-1），反應器內三氮比值變化無明顯規律，該階段反應器處于活性遲滯期，在進水高DO濃度條件下，系統中大部分NH4+-N和NO2--N被氧化為NO3--N，AnAOB活性較低。階段Ⅰ-2，通過化學除氧并提高進水底物濃度后，促進了AnAOB生長，R1和R2逐漸趨于理論值，系統展現出較高的Anammox活性。
反應器進入穩定運行期Ⅱ和Ⅲ后，分別通過階梯式提高進水底物濃度和縮短HRT，AnAOB逐漸富集并占據優勢。R1和R2均逐漸趨于穩定，其中R2穩定在理論值（0.20）左右，可見，系統形成穩定的Anammox脫氮效應。值得指出的是，本研究R1一直略低于理論值，這是由于為使NO2--N得到充分反應，進水NH4+-N和NO2--N比例控制為1∶1，原始基質R1小于理論值；此外，進水添加Na2SO3除氧生成SO42-，在硫酸鹽型還原菌作用下NH4+-N被氧化生成NO2--N，進而增加了NH4+-N消耗量。
2.3 污泥微觀形態特征分析
取系統穩定運行至第460天的MBR膜表面污泥和系統內顆粒污泥，通過SEM觀察污泥表面微觀形態，結果見圖5。
由圖5（a）可知，MBR膜表面主要由“團簇”狀生物聚集體構成。選取某一處長度為384.0μm的聚集體，將其表面緊密平實處（箭頭1處）放大4000倍（圖5（b））及40000倍（圖5（c）），可見，膜表面污泥主要由形狀大小一致、分布均勻的球菌（箭頭2、4處）和絲狀菌（箭頭3、5處）構成。據文獻報道，AnAOB形態多樣，多呈不規則的球狀、卵狀，常聚集生活，可知這些細菌形態和群聚程度符合AnAOB及其共生菌的特點。球菌緊密黏連，呈“團簇”狀分布，團狀物之間分布著氣體孔道，用于傳輸基質及釋放氣體，這是因為AnAOB自身能分泌胞外聚合物（EPS），產生黏連作用，同時能幫助細胞表面形成多孔結構，促進微生物聚集。由于膜組件具有良好的截留作用，其表面污泥中球菌聚集度高且結構緊密。膜表面污泥中同樣含量較多的是纏繞、包裹著生物聚集體的絲狀菌，它們連接著不同球菌，呈現穩定的共生狀態，為細菌進行胞外營養轉移或電子傳遞提供通道，這與蘇雪瑩等相關研究一致，認為少量絲狀菌有助于其他菌種在填料上的固定，與附在其上的菌膠團細菌形成共生的微生物生態體系。
5（d）為Anammox系統中顆粒污泥放大500倍的表面形態，對比MBR膜表面污泥發現，顆粒污泥表面形狀不規則，球菌大小差異明顯，且將桿菌等其他細菌包裹其中（箭頭7處）；表面分布著較多不規則氣道，孔隙較大，更有利于基質傳輸。選取圖5（d）箭頭6處放大5000倍（圖5（e）），發現大球菌表面黏連著很多微小球菌。進一步選取箭頭8處放大至20000倍（圖5（f）），觀察到緊密連接、形狀均勻的小球菌。此外，顆粒污泥表面含有少量絲狀菌（箭頭9、10處）。
2.4 脫氮機理解析
在系統啟動和穩定運行階段，對Anammox反應過程中的關鍵酶活性和微生物群落結構進行采樣分析。反應器接種污泥標記為AMX0，啟動成功（第135天）和各階段穩定期（第292天和第480天）的膜表面污泥和顆粒污泥樣本，分別標記為AMX11、AMX12，AMX21、AMX22和AMX31、AMX32。
2.4.1 酶活性變化
NIR在Anammox和反硝化代謝過程中將NO2--N轉化為NO，其活性表征了AnAOB與反硝化細菌總體活性；HZS和HDH為AnAOB中關鍵酶，HZS表征Anammox反應中NO和NH4+-N轉化成N2H4的過程，HDH表征N2H4轉化為N2的過程，是Anammox反應的限速步驟，對Anammox活性更具指示性；DHA表征反應器內有機物降解效果。不同階段的酶活性變化如圖6所示。
由圖6可知，系統成功啟動后，各階段NIR活性較初始接種污泥變化不大，這是因為初始接種污泥為運行良好的厭氧池活性污泥，其中存在反硝化過程，NIR本身活性已較高。但各階段HZS和HDH活性與初始接種污泥相比均有所提升，NO2--N還原生成的NO和NH4+-N在HZS作用下生成N2H4，N2H4在HDH作用下轉化為N2脫除，NH4+-N去除率升高，說明Anammox活性穩定提升。由圖6還可以看出，各階段MBR膜表面HZS活性明顯高于顆粒污泥（p<0.05），HDH活性較顆粒污泥略有提高，說明MBR膜表面Anammox反應活性高于顆粒污泥，這可能是由于水力剪切作用，不僅促進了膜表面生物膜更新，而且有利于物質傳遞。結合污泥微觀形態分析，穩定運行的膜表面污泥中球菌聚集度較顆粒污泥更高，且結構更緊密，同樣證明MBR膜表面Anammox反應活性更高。
值得注意的是，相較于階段Ⅰ，階段Ⅱ的DHA活性在MBR膜表面升高，在顆粒污泥中降低，而MBR膜表面和顆粒污泥的NIR、HZS和HDH活性無明顯差異，這說明提高進水基質濃度對MBR膜表面反硝化促進作用更明顯。階段Ⅲ（293~480d）運行結束時，MBR膜表面污泥中HDH顯著下降（p<0.05），而顆粒污泥中仍保持不變，推測HRT對膜表面聯氨脫氫過程影響更為顯著。最終DHA活性不再有明顯變化，可知Anammox和反硝化反應較為穩定，進一步說明反應器內存在穩定的協同脫氮機制。
2.4.2 微生物群落結構分析
通過研究反應器啟動和運行過程中微生物群落結構的組成和群落演替過程，推斷反應器運行情況，以期探明AnAOB富集過程。
①菌群豐度及多樣性
不同階段樣品α多樣性指數見表2。可知，Anammox-MBR啟動成功后（第135天），與接種污泥相比，膜表面污泥樣本的OTUs、Chao1與ACE指數均明顯降低，而顆粒污泥樣本的指數則大幅上升，說明反應器啟動過程提高了顆粒污泥中微生物菌群的豐度，降低了膜表面污泥中微生物豐度。推測這是由于啟動過程中進水條件變化促進了懸浮系統中的多種菌群增殖，而MBR膜表面Anammox反應活性高，對AnAOB的富集程度高，因此微生物豐度較低。
當系統達到穩定后（第292天），膜表面污泥中各項指數未發生明顯變化，而顆粒污泥中OTUs、Chao1、ACE與Shannon指數均顯著降低，即微生物豐富度和多樣性有所下降，這是因為攪拌篩選后的絮狀污泥在顆粒化過程中不斷富集Anammox菌種、淘汰劣菌，功能菌優勢凸顯。隨著系統運行趨于結束（第480天），膜表面污泥與顆粒污泥中OTUs、Chao1與ACE指數均顯著降低，說明系統在不同生態位中均強化了AnAOB富集程度。
由表2還可以看出，各階段膜表面污泥和顆粒污泥中Shannon指數較接種污泥均明顯下降，生物多樣性降低，說明MBR在截留富集微生物時能有效縮短菌種篩選時間，提高富集程度。此外，各階段Simpson指數、Coverage指數無顯著差異，表明各階段樣品分布均勻度與測序深度相似，測序結果可以有效反映污泥中微生物菌群分布情況。
②微生物菌群在屬水平的比較
不同樣品在屬水平上的微生物群落結構分布如圖7所示，檢測到Candidatus_Brocadia、Candidatus_Jettenia和Candidatus_Kuenenia三種AnAOB。
當系統運行至第292天時，AnAOB豐度達到最高水平，相對豐度從0%上升至20.78%（MBR膜表面污泥）和22.79%（顆粒污泥），Anammox功能菌高度富集，且豐度顯著高于其他相關研究。在Anammox-MBR運行過程中，AnAOB在系統中總豐度增長幅度差異明顯。膜表面污泥在運行至第135天和第292天時，AnAOB豐度分別增長了10.42%和10.36%，而顆粒污泥中AnAOB豐度分別增長了4.77%和18.02%，這是因為隨著進水氮負荷的提高，厭氧氨氧化菌群豐度不斷上升。在第480天，AnAOB豐度下降，這是因為進水氮負荷不變而HRT減小，AnAOB抗水力沖擊負荷能力較弱，導致Anammox功能菌豐度有所下降，而后保持穩定。MBR膜表面較顆粒污泥AnAOB豐度增加較早，與關鍵酶分析結果一致。
占比最高的Candidatus_Brocadia偏好于在生物膜中生長，MBR的有效截留使得表面生物膜厚度不斷增加，有利于該菌屬在其中繁殖。而啟動階段反應器內由于不斷進行攪拌并未形成顆�；勰�，穩定運行后關閉攪拌機，污泥聚集形成顆粒狀態后Candidatus_Brocadia增殖較快，說明采用MBR和連續攪拌耦合的方式能夠大大縮短Anammox啟動時間，提高AnAOB富集效果。Candidatus_Jettenia在HRT降低后于膜表面的豐度增加，推測其在3種AnAOB中具有較強的抗水力沖擊負荷能力，且在膜表面效果更好。一般AnAOB在特定Anammox系統中往往只有一種功能菌占主導地位，而在本研究中MBR表面生物膜與顆粒污泥共存的方式可以富集出多種功能菌，能夠有效提高不同條件下的脫氮效率。
值得注意的是，不動桿菌屬（Acinetobacter）在階段Ⅰ與階段Ⅲ結束時的豐度都較高，前者是因為Acinetobacter對環境的適應時間較短，后者是因為HRT降低，反硝化作用相對增強，且其在顆粒污泥中豐度高于膜表面污泥，與酶活性分析結果一致。此外，Bacillus在第135天并未表現出明顯的富集效果，而階段Ⅱ結束時，在膜表面和顆粒污泥中豐度分別達到19.19%和23.79%。有報道認為Bacillus中相關菌種具有硫酸鹽型還原功能，能以硫酸鹽為電子受體氧化NH4+-N生成NO2--N，因此認為該菌屬在該階段的大量富集與進水中投加Na2SO3除氧生成硫酸鹽有關。在第480天，反應體系中未檢出Bacillus，據研究，HRT越長越有利于Bacillus生長，則推測這是由于HRT減小，Bacillus菌屬生長受到抑制所致。
3、結論
①采用中試規模的Anammox-MBR，接種污水廠厭氧污泥，經過135d的培養，系統成功啟動，有效縮短了Anammox啟動時間，并可提升顆粒污泥活性。
②在480d的啟動和穩定運行過程中，通過階梯式提高進水底物濃度和縮短HRT，提升反應器運行負荷與脫氮性能，運行結束時NRR最高可達1.36kg/（m3·d）。
③在MBR膜表面和顆粒污泥中均觀察到球狀AnAOB，膜表面污泥中“團簇”狀球菌聚集度高，表面結構緊密；而顆粒污泥表面形狀不規則，且將桿菌等其他細菌包裹其中。
④Anammox-MBR馴化過程中MBR膜表面污泥和顆粒污泥中AnAOB總豐度分別達到20.78%和22.79%，實現了同一體系不同生態位多種功能菌的高度富集。（來源：南京市給排水工程設計院有限公司，東南大學土木工程學院）
