由于部分城鎮地區的污水收集管網不完善，導致污水處理廠進水C/N較低，不能有效實現生物脫氮。因此，污水處理廠常采用外加碳源的方式來滿足微生物代謝需求，常用碳源包括甲醇、乙酸、乙醇和葡萄糖等，但均存在運行成本高、資源浪費等問題。此外，有研究利用活性污泥發酵液、檸檬酸生產廢水的濃縮液、藍藻發酵液等高濃度有機廢水作為碳源，取得了一定的脫氮效果。Fu等認為利用某些高濃度工業廢水作為碳源，具有資源利用率高、生物降解性好的優勢。
高濃度白酒釀酒廢水的COD較高，富含小分子醇類、酸類和醛類等物質，可生化性好，是一種優質的反硝化碳源。筆者采用高濃度白酒釀酒廢水作為液體碳源，構建反硝化生物處理系統，并研究容積負荷、溶解氧和停曝比對脫氮效能的影響，進一步通過三維熒光光譜、掃描電子顯微鏡和宏基因組分析系統的微生物作用機理，旨在為釀酒廢水的資源化利用和低C/N生活污水處理提供技術支撐，實現“以廢治廢”。
1、材料與方法
1.1 實驗材料
采用移動床生物膜反應器（MBBR）接種污水處理廠濃縮池污泥，通過混合廢水（COD=350mg/L、NH4+-N=37.5mg/L、TN=40mg/L、TP=4mg/L）培養3d，待系統掛膜完成后開始處理污水。進水采用人工模擬低C/N生活污水（COD=65mg/L、NH4+-N=35mg/L、TN=35mg/L、TP=2mg/L），加入白酒釀酒廢水（COD=270000mg/L、NH4+-N=2500mg/L、TN=6500mg/L、TP=2400mg/L）作為碳源，并添加微生物所需營養物質：CoCl2·6H2O=0.15mg/L、FeSO4·7H2O=0.3mg/L、Na2MoO4·2H2O=0.06mg/L、CuSO4·5H2O=0.06mg/L、MnCl2·4H2O=0.12mg/L、H3BO3=0.15mg/L、KI=0.15mg/L、ZnSO4·7H2O=0.12mg/L、Na2WO4·2H2O=0.06mg/L、NiCl2·6H2O=0.15mg/L。
第一階段，控制溶解氧濃度為5～6mg/L，反應器內溫度為（30±1）℃，采用間歇式運行方式（23.5h反應+0.5h換水），通過單因素實驗研究容積負荷對系統脫氮效能的影響；第二階段，在最佳容積負荷條件下，通過單因素實驗研究溶解氧濃度對系統脫氮效能的影響；第三階段，在最佳容積負荷和最佳溶解氧濃度條件下，研究停曝比對系統脫氮效能的影響。
1.2 實驗方法
1.2.1 水質理化指標測定
NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測定，TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定，TP采用鉬酸銨分光光度法測定，COD采用快速消解分光光度法測定，pH和DO采用HACH便攜式多參數數字化分析儀測定。
1.2.2 三維熒光光譜分析
三維熒光光譜采用熒光光譜儀測定，激發光源為150W氙燈，固定激發波長狹縫為5nm，掃描速度為12000nm/min，激發波長λEx=250~800nm，發射波長λEm=250~800nm，光電倍增管（PMT）電壓為700V，響應時間為自動。
將所測得的光譜圖案按特定激發、發射波長劃分為7個區域，各區域位置及其所代表的熒光物質如表1所示。
1.2.3 掃描電子顯微鏡分析
采集最佳反應條件下反應器中的生物膜，參考李彥澄等的實驗方法對生物膜進行離心、固定、清洗、脫水、置換、鍍金處理后，采用掃描電子顯微鏡觀察并拍照。
1.2.4 宏基因組分析
采集反應器中的生物膜保存于無菌EP管，并立即置于-80℃超低溫冰箱內冷凍保存，然后在冷凍條件下送至上海某生物公司進行宏基因組測序，主要流程為：使用FastDNASpinKitForSoil試劑盒抽提樣品DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA完整性，采用基因組剪切儀對檢測合格后的DNA片段進行剪切，打斷為約400bp的片段，構建PE文庫后進行橋式PCR擴增和Illumina測序。最后利用宏基因組云平臺對得到的原始數據進行分析，包括物種種類、功能豐度和代謝通路分析等。
2、結果與討論
2.1 污染物去除效能
當容積負荷分別為0.044、0.067、0.089和0.111kgCOD/（m3·d）時，對應進、出水污染物平均濃度及去除率如圖1（a）所示。在不同容積負荷條件下，NH4+-N去除率均高于90%；當容積負荷為0.111kgCOD/（m3·d）時，TN和COD的去除率均最高，說明該系統的最佳容積負荷為0.111kgCOD/（m3·d）。
在系統容積負荷為0.111kgCOD/（m3·d）的條件下，溶解氧分別控制為1~2、2~3、3~4、4~5mg/L，結果如圖1（b）所示。在不同溶解氧條件下，系統對COD和NH4+-N的去除率均高于90%，且不隨溶解氧濃度的變化而出現較大波動，但TN去除率隨溶解氧濃度的增加而降低。當溶解氧為1~2mg/L時，TN去除效果最好，說明該系統的最佳溶解氧為1~2mg/L，在該條件下，系統同時具有較好的硝化與反硝化效能。
在容積負荷為0.111kgCOD/（m3·d）、溶解氧為1~2mg/L的條件下，采用間歇曝氣方式，控制停曝比分別為4∶1、3∶1、2∶1和1∶1，結果如圖1（c）所示。在不同停曝比條件下，系統對COD的去除率均為94%左右；NH4+-N去除率隨停曝比的減小呈升高趨勢，當停曝比為1∶1時，NH4+-N去除率高達（90.9±2.7）%；但TN去除率隨停曝比的減小呈先升高后降低的趨勢，在停曝比為3∶1時，TN去除率最高，說明系統的最佳停曝比為3∶1。
2.2 溶解性有機物分析
通過三維熒光光譜分析系統進、出水溶解性有機物的變化，了解微生物對其利用情況。采集最佳控制條件下的系統進、出水進行三維熒光光譜分析，結果如圖2所示。進水均在Ⅲ區檢測到熒光峰，且熒光強度最高，在Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ區也出現一定強度的熒光帶，說明進水主要為類溶解性微生物代謝產物，也有一定濃度的類色氨酸蛋白質物質、類富里酸物質、類黑精物和類木質纖維素物質。出水熒光譜圖中Ⅲ區的熒光強度明顯減弱，熒光峰明顯降低甚至消失，說明釀酒廢水中的類溶解性微生物代謝產物被系統中微生物較好地利用。此外，出水在Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ區檢測到的熒光強度均有所降低，說明出水中類色氨酸蛋白質物質、類富里酸物質、類黑精物和類木質纖維素物質在一定程度上被系統中的微生物降解。
2.3 微生物形態分析
通過掃描電子顯微鏡觀察最佳控制條件下反應器中的生物膜形態，結果如圖3所示。可知，系統中的微生物主要呈球狀、桿狀、絲狀和螺旋狀，這與Fan等研究中觀察到的微生物形態類似。好氧生物膜的微生物通常呈絲狀、桿狀和球狀，這些細菌參與同步硝化反硝化過程。絲狀菌在生物膜骨架中能為微生物附著提供有利環境，聚集更多微生物；球狀菌為NO2--N的積累提供了可能；桿狀菌可作為NH4+-N氧化的交換通道。此外，硝化菌和反硝化菌多為桿狀菌，如硝化桿菌、芽孢桿菌等。因此，合理控制容積負荷和溶解氧濃度有利于系統中微生物發生同步硝化反硝化作用，這主要是因為適量的碳源能為微生物提供電子供體，而在適宜的溶解氧濃度下，生物膜外層好氧區的微生物能較好地實現硝化作用，內層缺氧區則有利于微生物進行反硝化。
2.4 宏基因組分析
選取接種污泥（S0）、最佳容積負荷（S1）、最佳溶解氧濃度（S2）和最佳停曝比（S3）階段的微生物樣本進行宏基因組分析，各樣本序列的組裝拼接結果統計如表2所示（序列數分別為743040、598680、563910、577205）。
由表2可知，在4組樣本中，S0的序列數和總序列長度均高于S1~S3，說明經混合廢水培養后，系統的微生物物種數量減少。N50和N90分別為組裝序列的累加值第一次超過所有序列總長度的50%和90%時所掃描到的序列長度，在4組樣本中，S2的N50和N90最大。4組樣本的最短序列長度均為300bp，而所含序列最長的樣本為S1。
屬水平上的物種豐度對比見圖4（a）。S0的優勢屬分別為unclassified_c__Actinobacteria（4.97%）、unclassified_p__Chloroflexi（4.81%）、unclassified_c__Anaerolineae（4.60%）、unclassified_p__Bacteroidetes（4.55%）、小念珠菌屬、硝化螺菌屬。S1的優勢屬分別為微白霜菌屬、丙酸菌屬、unclassified_c__Deltaproteobacteria（4.12%）、中村氏菌屬、unclassified_p__Acidobacteria（2.66%）。S2的優勢屬分別為Micropruina（14.46%）、Propionibacterium（9.82%）、unclassified_p__Chloroflexi（3.87%）、unclassified_c__Deltaproteobacteria（2.74%）、Nakamurella（2.74%）。S3的優勢屬分別為Micropruina（26.22%）、Propionibacterium（13.83%）、Nakamurella（2.97%）、unclassified_p__Actinobacteria（2.89%）、unclassified_p__Chloroflexi（1.60%）。與接種污泥相比，系統中豐度變化較大的菌屬分別為Micropruina、Propionibacterium、Nakamurella，說明經混合廢水培養后優勢屬發生變化。Nakamurella作為硝化菌屬，在生物脫氮中起著關鍵作用；Micropruina能促進有機物的降解以及氮的去除；Propionibacterium作為去除有機物的功能菌屬，能以乳酸作為碳源，在微好氧條件下生長，而高濃度白酒釀酒廢水中富含高濃度的有機酸類物質。同時，Nakamurella和Micropruina能在細胞內儲存大量的糖類聚合物，可以發酵白酒釀酒廢水中由谷物產生的大量氨基酸和糖類，這可能與有機物的去除有關。S1～S3中的unclassified_p_Chloroflexi較S0有所降低，這可能與TN、NH4+-N被去除有關。種水平上的物種豐度見圖4（b）。豐度變化較大的菌種為Micropruina_glycogenica、Propionibacterium_sp.、Actinobacteria_bacterium、Nakamurella_multipartita、Anaerolineae_bacterium。在最優控制條件下，均出現優勢種Micropruina_glycogenica，這是因為該菌株為典型的聚糖菌，可在缺氧條件下將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，在脫氮過程中起著重要作用。此外，相關研究發現，Actinobacteria_bacterium和Anaerolineae_bacterium中存在與氮循環相關的功能基因，具有生物脫氮功能。Nakamurella_multipartita能在細胞中積累大量多糖，常存在于含糖廢水中，因此當添加釀酒廢水后，S1~S3均出現了Nakamurella_multipartita。
基于KEGG數據庫對微生物功能進行注釋，結果如圖5所示。4組微生物樣本的碳代謝過程均注釋到6種功能，其中代謝功能占主導地位，其次是人類疾病、環境信息處理、組織系統、細胞過程、遺傳信息處理；氮代謝過程均注釋到4種功能，其中代謝功能占主導地位，其次是環境信息處理、細胞過程、組織系統。碳代謝和氮代謝過程中參與代謝功能的微生物豐度最大，且均呈現S0整體豐度最小、S3整體豐度最大的現象。
進一步分析碳代謝和氮代謝的完整路徑，發現4組樣本中存在47條與碳代謝相關的完整路徑，包括碳水化合物代謝（21條）、能量代謝（24條）、甲烷代謝（2條）。在碳代謝過程中豐度較高的分別為：三羧酸（TCA）循環、Arnon-Buchanan循環、Embden-Meyerhof途徑、第二次碳氧化。4組微生物樣本中與氮代謝相關的完整路徑有6條，包括反硝化作用、異化硝酸鹽還原、完全硝化、硝酸鹽同化作用、固氮作用、硝化作用，其中反硝化作用占主導地位。
3、結論
采用高濃度白酒釀酒廢水作為反硝化液體碳源，當容積負荷為0.111kgCOD/（m3·d）、溶解氧濃度為1~2mg/L、停曝比為3∶1時，系統的脫氮效率最高。通過三維熒光光譜分析發現，系統對類溶解性微生物代謝產物的去除效果較為明顯，對類色氨酸蛋白質物質、類富里酸物質、類黑精物和類木質纖維素物質等有一定的降解。采用掃描電子顯微鏡發現，微生物主要為球狀、桿狀、絲狀和螺旋狀。通過宏基因組分析發現，系統中的優勢屬為Micropruina、Propionibacterium、Nakamurella。基于KEGG數據庫功能注釋結果顯示，代謝功能占主導地位，系統中與氮代謝相關的完整路徑有6條，其中以反硝化功能為主；與碳代謝相關的完整路徑有47條，其中以TCA循環為主。（來源：貴州大學資源與環境工程學院喀斯特地質資源與環境教育部重點實驗室，貴州喀斯特環境生態系統教育部野外科學觀測研究站）
