申請日2014.10.27
公開(公告)日2015.01.28
IPC分類號C12N1/20
摘要
本發明公開了一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，具體包括以下步驟：(1)SRB富集培養基的制備;(2)SRB分離培養基的制備;(3)SRB的富集培養;(4)SRB的分離培養;(5)SRB的純化培養，本發明具有分離純化的速度快，從SRB富集和分離培養基的制備到純化培養物只需要3d～5d，分離純化的成功率高，一次分離純化既可得到純化培養物，操作簡單、對操作人員要求較低，針對性強，本方法只適合進行SRB菌種分離純化，因此，可廣泛地應用于油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化中。
權利要求書
1.一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟：
(1)SRB富集培養基的制備
將富集培養基溶于蒸餾水中，厭氧分裝到容積為7.8ml的厭氧瓶中，每瓶分 裝7ml，121℃高壓蒸汽滅菌，其中，富集培養基配方為乳酸鈉質量濃度0.4%～ 0.6%、硫酸亞鐵銨質量濃度0.05%～0.2%、酵母浸粉質量濃度0.05%～0.1%、氯 化鈉質量濃度0.5%～2.0%、氯化鎂質量濃度0.01%～0.03%;
(2)SRB分離培養基的制備
將分離培養基溶于蒸餾水中，加熱至充分溶解，然后厭氧分裝到容積為 7.8ml的厭氧瓶中，每管7ml，121℃高壓蒸汽滅菌，滅菌完后自然降溫至50℃～ 55℃備用，其中，分離培養基配方為蛋白胨質量濃度0.8%～1.2%、肉浸粉質量 濃度0.9%～1.1%、乳酸鈉質量濃度0.4%～0.6%、硫酸亞鐵銨質量濃度0.05%～ 0.2%、酵母浸粉質量濃度0.05%～0.1%、氯化鈉質量濃度0.5%～2.0%、氯化鎂 質量濃度0.01%～0.03%、瓊脂粉質量濃度0.8%～1.5%;
(3)SRB的富集培養
取油田污水0.2ml注入上述制備好的富集培養基中，恒溫培養至培養液變黑 為止，得到富集培養物;
(4)SRB的分離培養
取0.77ml上述富集培養物用制備好的富集培養基按照10倍系列稀釋法稀釋 至10-4，將10-3和10-4梯度的稀釋液用1ml無菌注射器取0.1ml，分別緩慢注入 至上述50℃～55℃備用的分離培養基中，混合均勻，垂直靜置放置0.5h～1h得 到透明的半固體培養基，然后置于恒溫培養箱中培養，培養至培養基中出現黑 點為止，得到分離培養物;
(5)SRB的純化培養
取1管上述富集培養基，用1ml無菌注射器抽取0.2ml富集培養基，接著用 該注射器吸入分離培養物中輪廓清晰的黑點，然后注入該管富集培養基中，放 置在恒溫培養箱中培養，直到培養液變黑，得到純化培養物。
2.根據權利要求1所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特 征在于，所述的121℃高壓蒸汽滅菌，滅菌時間為20min～30min。
3.根據權利要求1或2所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法， 其特征在于，所述的滅菌完后自然降溫，為確保降溫均勻，降溫過程中緩慢滾 動厭氧管。
4.根據權利要求1或2所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法， 其特征在于，所述取油田污水現場采集后進行密封處理在4℃下保藏不超過7d。
5.根據權利要求1所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特 征在于，所述的恒溫培養至培養液變黑為止，得到富集培養物，恒溫培養溫度 為30℃～60℃。
6.根據權利要求1或5所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法， 其特征在于，所述的置于恒溫培養箱中培養，培養至培養基中出現黑點為止， 得到分離培養物，恒溫培養溫度為30℃～60℃。
7.根據權利要求1或5所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法， 其特征在于，所述的放置在恒溫培養箱中培養，直到培養液變黑，得到純化培 養物，恒溫培養溫度為30℃～60℃。
8.根據權利要求7所述的油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特 征在于，所述的放置在恒溫培養箱中培養，直到培養液變黑，得到純化培養物， 培養時間為1d～3d。
說明書
一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法
一、技術領域
本發明屬于石油微生物技術領域，特別涉及一種油田污水中硫酸鹽還原菌 的分離純化方法。
二、背景技術
硫酸鹽還原菌(SRB)是利用油田產出液中的硫酸鹽或者其它氧化態硫化物 作為電子受體來異化有機物質的微生物，它將SO42-還原成H2S，進而改變油田 水質的pH值和金屬的腐蝕狀態，是金屬腐蝕速率顯著增加的重要因素，對油田 管網帶來腐蝕、堵塞等諸多有害作用。
分離和純化SRB獲得純種的SRB單菌株，可以為油田環境的菌落結構分析 以及腐蝕現狀和水質情況的評價提供重要的理論依據。
現有的SRB分離純化方法有以下三種：稀釋搖管法、疊皿夾層法和Hungate 滾管法，但目前的方法存在著以下問題：(1)稀釋搖管法觀察和挑取菌落比較 困難，費時、費力效率低;(2)疊皿夾層法適用范圍小，分離純化的成功率低， 往往需要3次～6次重復的分離純化才能得到相對純化培養物;(3)Hungate滾 管對設備操作人員要求較高，操作復雜，分離純化效果低;(4)三種方法分離 方法時間均需要10d以上。
三、發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種油田污水中硫酸鹽還原菌 的分離純化方法。該方法具有工藝簡單、操作方便、材料易得、針對性強，對 操作人員及設備要求較低、經濟實用、分離純化速度快和成功率高的優點。
一種油田污水中硫酸鹽還原菌的分離純化方法，其特征在于，具體包括以 下步驟：
1、SRB富集培養基的制備
將富集培養基溶于蒸餾水中，厭氧分裝到容積為25ml的厭氧管中，每管分 裝9ml，121℃高壓蒸汽滅菌30min。
其中，富集培養基配方為乳酸鈉質量濃度0.4%～0.6%、硫酸亞鐵銨質量濃 度0.05%～0.2%、酵母浸粉質量濃度0.05%～0.1%、氯化鈉質量濃度0.5%～2.0%、 氯化鎂質量濃度0.01%～0.03%。
2、SRB分離培養基的制備
將分離培養基溶于蒸餾水中，加熱至充分溶解，然后厭氧分裝到容積為25ml 的厭氧管中，每管15ml，121℃高壓蒸汽滅菌30min，滅菌完后自然降溫至50℃～ 55℃備用。
其中，分離培養基配方為蛋白胨質量濃度0.8%～1.2%、肉浸粉質量濃度 0.9%～1.1%、乳酸鈉質量濃度0.4%～0.6%、硫酸亞鐵銨質量濃度0.05%～0.2%、 酵母浸粉質量濃度0.05%～0.1%、氯化鈉質量濃度0.5%～2.0%、氯化鎂質量濃 度0.01%～0.03%、瓊脂粉質量濃度0.8%～1.5%。
3、SRB的富集培養
取油田污水1ml注入上述制備好的富集培養基中，30℃～60℃恒溫培養至 培養液變黑為止，得到富集培養物。
4、SRB的分離培養
取1ml上述富集培養物用制備好的富集培養基按照10倍系列稀釋法稀釋至 10-4，將10-3和10-4梯度的稀釋液用1ml無菌注射器取0.1ml，分別緩慢注入至 上述50℃～55℃備用的分離培養基中，混合均勻，垂直靜置放置0.5h～1h得到 透明的半固體培養基，然后置于恒溫培養箱中培養，培養溫度為30℃～60℃， 培養至培養基中出現黑點為止，得到分離培養物。
5、SRB的純化培養
取1管上述富集培養基，用1ml無菌注射器抽取0.2ml富集培養基，接著用 該注射器吸入分離培養物中輪廓清晰的黑點，然后注入該管富集培養基中，放 置在恒溫培養箱中培養，培養溫度30℃～60℃，培養1d～3d直到培養液變黑， 得到純化培養物。
其中，所述步驟2中的滅菌完后自然降溫，為確保降溫均勻，降溫過程中 緩慢滾動厭氧管。
所述步驟3中的油田污水，其現場采集后進行密封處理在4℃下保藏不超過 7d。
本發明與現有技術相比具有如下優點：
(1)操作簡單、對操作人員要求較低;
(2)針對性強，本方法只適合進行SRB菌種分離純化;
(3)分離純化的速度快，從SRB富集和分離培養基的制備到純化培養物只 需要3d～5d;
(4)分離純化的成功率高，一次分離純化既可得到純化培養物。
