厭氧氨氧化(Anammox)工藝作為一項新型、節能的生物脫氮技術，受到了研究者的廣泛關注，因其能在厭氧條件下，利用氨氮、亞硝氮作為電子供體和電子受體，將二者同時轉換為氮氣而從反應體系中去除。然而該過程理論上會導致11%的硝酸鹽氮生成，為總氮去除率的提高帶來挑戰。且厭氧氨氧化菌(AnAOB)倍增時間長，具有生物質易流失、環境敏感度高的特點，易受到高濃度氮素帶來的抑制作用，從而影響體系的氮去除效率和穩定性。

為了改善目前Anammox反應體系存在的不利條件，投加生物炭成為了一種廣泛采用的方式。生物炭可以通過充當電子介導體促進Anammox體系中累積硝氮的還原從而提升總氮去除效果，同時也能通過促進細菌胞外聚合物(EPS)的分泌、增強功能基因的表達以緩解反應體系高氮負荷導致的微生物抑制。LI等研究得出在100mgN·L−1的Anammox反應體系中，生物炭的投加使硝氮還原速率提升了2.2倍，且生物炭提升了AnAOB和反硝化菌(DNB)等功能細菌的豐度；CHEN等研究得出Anammox活性在總氮質量濃度大于250mgN·L−1時逐漸下降，生物炭使上限提高至300mgN·L−1；而LI等研究表明總氮質量濃度在440mgN·L−1時，體系具有更高的微生物EPS分泌質量濃度以及更大的AnAOB相對豐度。因此，生物炭在不同氮負荷下對Anammox反應體系的影響效果差異較大。目前研究多為單一負荷下生物炭對Anammox體系的影響，而不同氮負荷下生物炭介導Anammox反應體系脫氮特征的差異與作用機理仍不明確，同時不同負荷影響下生物炭對微生物群落演替和代謝途徑的變化規律仍有待進一步探究。

因此，本研究通過進行批次實驗考察了3種氮負荷條件下(總氮為100、300、500mgN·L−1)生物炭強化Anammox體系脫氮性能的特征，結合氮轉化過程與生物炭表征、EPS、微生物分布、群落結構以及功能預測的分析，探討了生物炭強化不同氮負荷反應體系脫氮過程的差異與增效機理。

1、材料與方法

1.1 炭材料制備與理化性質測定

本研究生物炭原料采用蘋果木木屑。將木屑置于馬弗爐內，于300℃條件下熱解2h后冷卻至室溫，依次通過18目與35目篩網進行篩分，選取粒徑0.5~1mm生物炭干燥密封保存。

通過傅里葉變換紅外光譜儀(NicoletiS20，美國賽默飛世爾科技公司)測定生物炭表面官能團；場發射掃描電子顯微鏡(Quanta650F，美國FEI公司)拍攝生物炭形貌結構；將烘干后的生物炭研磨成粉末(過200目篩)，取50mg生物炭粉末以及稀釋10倍的萘酚(C10H8O)溶液以1∶6的比例混合并超聲30min，使其充分接觸。將混合溶液滴加100μL于玻碳電極上，35℃烘干后進行使用電化學工作站(CHI660E，上海辰華儀器有限公司)與三電極體系電解池(容積100mL)進行循環伏安法(CV)測定，表征反應前后生物炭的電化學性能變化。

1.2 種泥及試驗條件設置

本研究使用種泥取自實驗室穩定運行膨脹顆粒污泥床(expandedgranularsludgebed，EGSB)反應器，運行溫度為35℃，水力停留時間(hydraulicretentiontime，HRT)為10h，污泥質量濃度MLSS、MLVSS分別為7500、4700mg·L−1，顆粒污泥呈紅褐色。試驗前洗滌種泥，加入去離子水混合后傾倒上清液并重復3次，以去除殘留的NH4+、NO2−和NO3−，減少對試驗的影響。批次試驗均在工作體積為100mL的血清瓶中進行，反應體系中污泥質量濃度MLSS、MLVSS分別為1100、700mg·L−1。封瓶前用氮氣吹掃3min以去除血清瓶頂部氧氣，并立即用橡膠塞和鋁蓋密封。所有批次試驗均在恒溫振蕩器中進行，振蕩速度和溫度分別控制在120r·min−1和35℃。

1.3 不同氮負荷脫氮批次實驗

設置3組基質質量濃度，分別為總氮100、300、500mg·L−1，命名為TN100、TN300、TN500。采用人工配水，向總容積為120mL的血清瓶中加入50mL營養液，15mL種泥以及35mL去離子水以獲得100mL的工作體積。生物炭投加量為10g·L−1。營養液組成見表1。

1.4 檢測項目及方法

1)水質指標測定。

使用1mL無菌針管取出水樣后經微孔過濾器(0.45μm)過濾，過濾后的水樣用于分析NH4+、NO2−、NO3−的質量濃度。NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測定，NO2−-N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測定，NO3--N采用氨基磺酸分光光度法測定。

2)胞外聚合物提取與測定。

取血清瓶內全部污泥加入50mL離心管，加純水至45mL。預冷離心機至4℃，4000r∙min−1離心10min，取上清液過濾得到SMP(solublemicrobialproduct)；加入70℃的5‰的NaCl溶液至45mL。渦旋振蕩1min，6000r∙min−1離心10min后過濾上清液得到松散結合型EPS(LB-EPS)；最后將離心管加入70℃的5‰的NaCl溶液至45mL，并在70℃水浴30min，6000r∙min−1離心10min后過濾上清液得到緊密結合型EPS(TB-EPS)。提取EPS后烘干污泥，使用馬弗爐煅燒后通過差重計算微生物質量(gvss)。提取的3種胞外聚合物分別采用苯酚-硫酸法、Folin-酚法測定多糖(PS)、蛋白質(PN)的質量濃度。

3)三維熒光光譜測定。

采用日立熒光分光光度計(F-7000，日本Hitachi公司)測定EPS的熒光特性，發射波長范圍為200~500nm，激發波長為250~550nm，掃描間隔5nm，掃描速度為12000nm·min−1。

1.5 計算方法

根據公式(1)~(5)計算總氮去除效率(TNRE)、總氮去除速率(TNRR)、氨氮去除速率(NRR氨氮)、亞硝氮去除速率(NRR亞硝氮)及硝氮還原速率(NRR硝氮)。

式中：反應前后總氮的質量濃度變化，mg·L−1；：初始總氮質量濃度(氨氮、亞硝氮、硝氮之和)，mg·L−1；、：反應前后氨氮、亞硝氮的質量濃度變化，mg·L−1；：累積硝氮質量濃度最大值與反應結束質量濃度差，mg·L−1；：對應反應節點時間差，h。1.6微生物群落結構與功能分析反應結束后選取各實驗對照組與生物炭組污泥樣本一式二份進行16S微生物分類測序。使用E.Z.N.A™Mag-Bind土壤DNA試劑盒(M5635-02，美國OmegaBiotek公司)提取群落基因組DNA，使用Qubit4.0測量DNA的質量濃度，確保提取足夠的高質量DNA片段。在細菌16SrRNA基因的高變區V3–V4使用正向引物(341F，CCTACGGGNGGCWGCAG)和反向引物(805R，GACTACHVGGGTATCTAATCC)進行PCR擴增。測序完成后，使用PEAR處理fastq文件生成單獨的fasta和qual文件，通過Usearch對相似性高于97%的OTU進行聚類，選擇豐度最高的標記序列作為每個聚類的代表序列，利用RDP數據庫對細菌OTU代表序列進行分類并進行群落多樣性指數計算。利用PICRUSt對細菌進行代謝通路功能預測分析。

2、結果與討論

2.1 生物炭對不同氮負荷反應體系脫氮過程增效分析

TN100、TN300、TN500對照組最終總氮去除率為86.4%、85.1%和88.2%，生物炭的投加使各對照組的去除率分別提高了13.6%、4.5%和1.8%(圖1)，即生物炭對不同氮負荷反應體系總氮去除均有促進效果，且促進效果TN100>TN300>TN500。同時，反應結束后各實驗組中的TN100生物炭組具有最高的TNRR(0.103gN·L−1·d−1)以及最高的TNRE(100%)，說明低負荷條件下生物炭對厭氧氨氧化體系總氮去除的提升效果更佳。隨著總氮質量濃度的減少，反應過程可劃分為快速反應階段以及慢速反應階段。3種氮負荷的Anammox反應體系反應階段變化節點分別在12、25、54h。在快速反應階段中，氨氮與亞硝氮充足，脫氮過程以厭氧氨氧化反應(Anammox)為主導；在慢速反應階段中，亞硝氮的耗盡使Anammox反應的發生缺少理論條件，而對照組和生物炭組中剩余氨氮以及累積的硝氮均發生了緩慢的下降，這是源于反應體系中發生了部分反硝化作用(partialdenitrification，PD)，該過程能通過將快速階段中累積的硝氮還原成亞硝氮而使Anammox在慢速階段繼續進行反應。

反應結束時3組對照組的氨氮分別剩余11.8、37.1、54.9mg·L−1，而對應生物炭組的氨氮分別比對照組多降解了11.8、6.7、3.5mg·L−1；同時根據速率擬合結果(表2)顯示，TN100、TN300、TN500生物炭組的硝氮還原速率分別比相應對照組高2.1、1.8、1.4倍，說明生物炭的投加通過促進硝氮還原強化了PD過程，從而進一步提高了Anammox反應體系的總氮去除效果，但生物炭的增效作用在低負荷條件下更加顯著。這也與各負荷下反應體系氣體產量增加的促進效果相一致，TN100、TN300以及TN500生物炭組氣體產量分別高于對照組12.9%、7.1%以及4.2%，呈現遞減趨勢。

2.2 生物炭在不同氮負荷下強化脫氮效能機理

1)生物炭強化胞外電子傳遞對脫氮過程的影響。

通過傅里葉紅外光譜分析來表征原始生物炭以及3種氮負荷下反應結束后生物炭表面官能團的變化。結果如圖2(a)所示，反應后的生物炭表面有較多具有還原性的含氧供電子官能團，隨著氮負荷的升高其吸收峰均有不同程度的減弱，其中，酚羥基(d:3410cm−1，-OH)以及醌類基團(b:1610cm−1)尤為明顯。據研究，生物炭表面存在的酚羥基具有較強的供電子能力；醌類官能團可充當細菌的胞外電子受體，通過可逆的氧化還原循環作用促進體系中硝氮的還原；同時芳香烴基團(a:800cm−1，c:2880cm−1，-CH)也能通過具電活性的共輒π電子系統促進硝氮還原過程，生物炭的芳香性越強，其電活性越強，與表面官能團的氧化還原得失電子過程不同，這種電子轉移過程不需要化學反應，電子傳遞速度更快。因此由上述官能團吸收峰的減弱趨勢可知：反應體系中氮負荷的提高意味著更多的官能團需求，由于生物炭表面官能團的數量與供電子能力有限，因此生物炭對低氮負荷下的Anammox反應體系總氮去除具有更顯著的促進效果。根據原始生物炭和不同氮負荷反應后生物炭的循環伏安曲線圖顯示(圖2(b))，原始生物炭曲線軌跡中出現了一對不可逆的氧化峰與還原峰，具有一定的氧化還原能力。而不同負荷反應后生物炭的曲線圖中還原峰均有一致程度的減弱，與部分還原性官能團的減少趨勢一致，說明原始生物炭的還原性能在不同氮負荷反應體系中均被消耗，而由于氮負荷的逐漸提高，生物炭對低氮濃度的反應體系具有更好的促進效果。

2)生物炭對EPS組分及質量濃度的影響。

將各對照組與生物炭組于快速反應階段、慢速反應階段結束時分批拆瓶(TN100：12h、28h；TN300：25h、90h；TN500：54h、195h)，提取EPS進行相關指標測定。EPS與AnAOB的代謝和活性密切相關且發揮著重要作用，主要由PS和PN組成。由圖3(a)可知，反應期間生物炭組的EPS(PN+PS)含量基本高于對照組，且各試驗組的EPS質量濃度均隨著氮負荷的提高而下降，這與YANG等的研究結果一致可能源于EPS中的部分有機成分參與硝氮還原的自養反應而被消耗。慢速階段的平均EPS質量濃度均低于快速階段，這是由于更高氮負荷體系會產生更高的累積硝氮總量，而EPS在無外加碳源的自養體系中充當唯一的有機碳源，因此在參與硝氮還原的過程中消耗量逐漸增大。TN100組生物炭對EPS濃度的提升效果最佳，且提升效果隨著負荷的增加而下降，這與生物炭促進硝氮還原速率提高的趨勢一致，可能是因為生物炭通過其氧化還原活性與供電子能力促進了硝氮還原過程，從而強化細菌代謝與EPS的分泌。

EPS組分分析顯示，PN是EPS的主要組成部分，其在各實驗組EPS含量中比例超過80%，這可能源自于EPS在微生物和底物之間作為離子運輸通道的能力以及自身參與此類主動運輸的結果。有研究表明，PN/PS是表示顆粒污泥穩定性的指標，較高的PN/PS比容易導致Anammox顆粒污泥的強度降低和沉降能力下降，而TN100對照組與生物炭組平均PN/PS值為6.6、6.2，低于TN500的8.0、7.1。綜上所述，生物炭在較低氮負荷下強化Anammox反應體系EPS分泌含量更加顯著，同時具有最低的PN/PS比，說明生物炭的投加提高了微生物團聚和穩定性，從而實現低氮負荷下生物炭組更好的脫氮性能。

圖3(b)展示了反應結束后各負荷下對照組與生物炭組的三維熒光光譜特性。EPS中各種蛋白質物質可根據不同特性分為5個區域：芳香類蛋白質Ⅰ(Ⅰ)、芳香類蛋白質Ⅱ(Ⅱ)；富里酸(Ⅲ)；可溶性微生物產物(IV)；腐植酸(V)。在各組熒光圖譜中總共確定了3個主要峰：Ex/Em=(235~240)nm/(325~330)nm、Ex/Em=(235~240)nm/(345~345)nm以及Ex/Em=(275~280)nm/(335~340)nm，即芳香類蛋白質Ⅰ(Ⅰ)、芳香類蛋白質Ⅱ(Ⅱ)和可溶性微生物產物(Ⅳ)。可以發現各生物炭組中這些峰的熒光區均高于相應對照組，其中增加最明顯的區域為可溶性微生物產物，且其熒光區強度與面積的增加程度隨著氮負荷的提高而減少。研究表明EPS中的可溶性微生物產物的含量水平可反映厭氧微生物的活性，而生物炭提升不同氮負荷反應體系脫氮效果的趨勢與EPS中可溶性微生物產物的減少趨勢一致，說明低負荷反應體系具有更強的微生物活性，從而促進了低氮負荷條件下總氮去除效果的提升。

2.3 微生物群落演替特征及代謝變化

1)生物炭對群落結構及聚集特征的影響。

高通量測序結果顯示，各負荷下Anammox反應體系中在門水平占主導的微生物主要包括Planctomycetes(浮霉菌門)、Proteobacteria(變形菌門)、Chloroflexi(綠灣菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、Armatimonadetes(裝甲菌門)、Ignavibacteria以及unclassifiedBacteria。反硝化菌屬一般隸屬于Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes，厭氧氨氧化菌屬隸屬于Planctomycetes。

反應體系內主要的屬為CandidatusKuenenia、unclassifiedBetaproteobacteria、unclassifiedBacteria、unclassifiedAnaerolineaceae等，其中CandidatusKuenenia為Anammox反應體系中最主要的AnAOB；同時體系中有多種DNB共存，如Acinetobacter、Afipia、Ignavibacterium、Pseudomonas、Chryseobacterium等。生物炭的投加提高了AnAOB的豐度，提升效果最佳為TN100生物炭組，相較于對照組提高了11.0%，TN300生物炭組和TN500生物炭組分別提高了7.4%與4.4%(圖4(a))；其次，生物炭也促進了Acinetobacter和Afipia這2種優勢DNB豐度的提高，且TN100生物炭組總反硝化菌屬豐度提升程度最高為8.4%，與TN100生物炭組具有最優總氮去除效果對應。此外，Armatimonadetesgp5具有降解多糖的能力，其豐度隨氮濃度的增加而提高，符合EPS組分中多糖的降解趨勢。

基于研究結果進行了Mantel檢驗，分析了關鍵菌屬與不同環境因子之間的相關性(圖4(b))。結果顯示，關鍵AnAOB和DNB的豐度與TNRE具有相關性，如CandidatusKuenenia(｜r｜=0.67，p<0.05)、Acinetobacter(｜r｜=0.73，p<0.01)，為提升TNRE的主要作用菌群。而Ignavibacterium與PN、PS質量濃度具有相關性(｜r｜=0.86，p<0.05，PN；｜r｜=0.82，p<0.05，PS)，說明Ignavibacterium可能在EPS的消耗過程中發揮重要作用。其次，Pearson相關性分析顯示，TN與PN/PS呈正相關(r=0.82)，說明氮負荷的提高影響了EPS的組成；TNRR與PN、PS呈正相關(r=0.94、r=0.95)，體現出脫氮速率高的反應體系具有更高的EPS分泌水平。

根據掃描電鏡圖(圖5）顯示，在不同氮負荷條件下，微生物聚集情況具有一定差異。根據種子顆粒污泥表面菌群形態(圖5d）可知微生物的主要形態為球狀，與各氮負荷反應體系中生物炭表面富集的細菌形態一致。在3種Anammox反應體系中，由于TN500生物炭組氮負荷最高從而具有更長的反應時間，生物炭上微生物的聚集更加顯著，以多個顆粒聚集體的形態黏附在生物炭表面。而在低氮負荷反應體系的TN100生物炭組中，反應后生物炭表面微生物富集程度較低，說明在高負荷反應體系中高濃度氮素的抑制作用影響微生物時，生物炭通過為細菌提供富集位點實現更長時期下總氮的穩定去除。

2)生物炭強化代謝。

根據KEGG數據庫比對結果選取氮代謝通路(M00910)進行分析，一共獲得38條三級代謝途徑，選取其中18條相關通路并按不同功能蛋白分成7類。如圖6所示，生物炭組中由EC：1.7.5.1、EC：1.9.6.1構成的硝酸鹽還原酶的豐度有顯著的增加，且隨著氮負荷降低而提高，說明低負荷反應體系(TN100)具有更高的硝氮還原強度；生物炭的投加增加了谷氨酸脫氫酶(EC：1.4.1.2/3/4)與谷氨酸合成酶(EC：1.4.1.13)的豐度，體現出生物炭增強了Anammox反應體系的細胞代謝活性，而TN100生物炭組相關功能蛋白豐度最高，從而實現了生物炭促進低氮負荷下反應體系總氮去除率提升更高的結果。

3、結論

1)不同氮負荷下生物炭對厭氧氨氧化總氮去除的提升效果為TN100>TN300>TN500，且相對于對照組分別提升了13.6%、4.5%、1.8%，同時TN100生物炭組具有最高的總氮去除速率(0.103gN·L−1·d−1)以及最高的總氮去除效率(100%)，說明低氮負荷條件下生物炭對厭氧氨氧化體系總氮去除的促進效果更佳，這是因為低氮負荷反應體系中生物炭促進PD過程更加顯著，實現了剩余氨氮與累積硝氮的深度去除。

2)生物炭表面含氧官能團提供的電子、生物炭本身的氧化還原能力以及促進微生物EPS分泌是強化硝氮還原過程的關鍵因素，總氮去除效率最高的TN100生物炭組具有更高的EPS平均質量濃度以及更低的PN/PS。

3)生物炭的投加提升了反應體系中主要AnAOB：CandidatusKuenenia與主要DNB：Acinetobacter和Afipia的豐度，同時生物炭增強了硝酸鹽還原酶相關功能蛋白的活性，其中TN100生物炭組具有最高豐度，實現了生物炭促進低氮負荷下反應體系總氮去除率提升更顯著的結果。（來源：西安建筑科技大學環境與市政工程學院，東北大學工程研究生院土木與環境工程系）