一、前言

　　目前，我國啤酒工業發展迅速，啤酒產量不斷增加，與此同時啤酒廢水的產生量也是逐年增加，例如，2002年我國啤酒廢水的排放量為2.7億桿，占全國工業廢水排放總量的1.3%。啤酒生產經歷制麥、糖化、發酵、罐裝等多道工序，產出廢水包括糖化廢水、洗滌廢水、廢酵母液和冷卻廢水等，一般每生產1t啤酒產生3-10t啤酒廢水。雖然啤酒廢水無毒，但是直接排放仍然會造成嚴重的環境污染。因此，如何能高效低能耗地處理發酵類型廢水成為備受關注的環境問題之一。啤酒廢水的主要成分有大量的淀粉、蛋白質、殘余啤酒以及洗滌用堿，其COD—般在2000-4000mg/L。由于啤酒廢水的可生化性較高，目前主要采用生物處理法處理，最常見的是厭氧與好氧聯合生物處理法

　　厭氧生物處理技術具有污泥產率低、容積負荷高、運行穩定性強、能耗低、可回收清潔能源和運行管理費用低等特點，因而被廣泛推廣與應用。目前厭氧反應器形式主要包括厭氧過濾器(AF)、厭氧流化床反應器(AFBR)、上流式厭氧污泥床反應器(UASB)、膨脹顆粒污泥床反應器(EGSB)和內循環厭氧反應器(IC)。IC反應器是由上下兩個UASB反應器串聯組合而成，上部是低負荷區，底部是高負荷區，通過沼氣上升的方式使泥水充分混合。由于處理效果好、管理方便、運行穩定，特別適用于處理高濃度的有機廢水，因而被廣泛應用在啤酒廢水處理中，取得了較好的處理效果。本啤酒廠廢水的厭氧生物處理主要采用IC工藝，Q反應器對廢水COD的去除率達到了80%。在廢水的生物厭氧處理系統中，微生物多樣性對廢水處理效果的影響最為直接，為了更進一步了解廢水處理過程的內在機制，有必要對啤酒廢水主要工藝的微生物區系進行研究，并對厭氧污泥中的優勢功能微生物進行分離鑒定。

　　二、材料和方法

　　2.1污泥及廢水的采集

　　啤酒廢水取自啤酒廠廢水處理調節池。經測定，該廢水具有高COD和低氨氮的特點。以所取厭氧污泥為接種物，對該污泥進行微生物多樣性的分析，并從中分離功能微生物。

　　2.2厭氧污泥微生物多樣性分析

　　微生物的全基因組采用DNA提取試劑盒(北京莊盟)進行提取。以提取的基因組為模板，以通用引物515F/806R(515F：5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3';806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')擴增16SrRNA基因的V4區。將擴增的樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，利用IlluminaMiSeq測序平臺進行測序和微生物多樣性分析。

　　2.3優勢功能微生物分離篩選

　　直接向啤酒廢水中加入(/L)：NH4CI.25g，NaH2PO4，2H2O0.08g和NaHPO40.25g，利用高壓蒸汽滅菌(121°C，20min)后作為微生物分離鑒定及培養的培養基。利用高純氮對培養基進行充氣，以去除培養基中的氧氣。采用液體稀釋法分離厭氧污泥中的優勢功能微生物：稱取0.1g污泥介入上述培養基中培養7d作為接種物;將接種物在新鮮液體培養基中進行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配到w1個微生物。如果經稀釋后的大多數試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養物可能就是純培養物。如果經稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養物的幾率就會急劇下降。因此，采用稀釋法進行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數(一般應超過95%)表現為不生長。經過多輪的稀釋得到純培養的微生物，即為厭氧污泥中的優勢功能微生物。

　　2.4微生物鑒定

　　使用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取所分離出的細菌的基因組。以細菌基因組為模板，利用細菌16srRNA基因擴增通用引物27f和1492r，27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反向引物1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。Per擴增反應的條件：95℃的條件下預變性6min，95°C的條件下變性45s，55°C的條件下退火45S，72°C的條件下延伸90s，第二步到第五步循環30次，72°C的條件下延伸10min，per反應結束4°C下保存。擴增成功后得到的樣品需送往華大基因科技有限公司進行測序，16srRNA基因的測序引物和擴增引物相同。利用BLASTN程序將測出的基因序列與已承認的所有已知細菌的16srRNA基因進行比對(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，獲得所測序列與已知序列之間的相似性數據。獲得相似度較高的序列之后，利用mega7.0對所獲得的每種基因的序列進行多序列比對，利用多序列比對的結果構建系統發育樹⑷。通常采用鄰接法、最大似然法和最大簡約法構建進化樹，其中鄰接法最常用，自展值常設定為重復1000次計算。

　　2.5廢水分析方法

　　啤酒廢水及出水樣品指標利用化學需氧量(COD)以及乙酸、丙酸、乳酸和乙醇含量來表征。COD測定：樣品用Milli-Q水稀釋10倍后COD快速測定儀(5BT型COD快速測定儀，連華科技，中國)測定COD。

　　樣品經12000xg離心2min后取上清液過0.22pm濾膜，用于乙酸、丙酸、乳酸和乙醇含量測定。乙酸、丙酸采用高效液相色譜儀(島津LC-20AT，島津，日本)測定。色譜條件：島津C18柱(4.6x150nm，5pm);流動相：48rnM磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調節pH至2.15);柱溫：30°C;進樣量10[1L;流速1.0mL/min;檢測波長210nm。乳酸采用高效液相色譜儀(島津LC-20AT，島津，日本)測定。色譜條件：島津C18柱(4.6x250nm，5pm);流動相：0.1%磷酸水溶液：乙月青=98：2(V：V);柱溫：35°C;進樣量100mL;流速1.0mL/min;檢測波長210nm。

　　乙醇采用配有FID檢測器氣相色譜儀(Agilent7890A，Agilent，USA)、頂空進樣器(Agilent7697A，Agilent，USA)、OV-1毛細管柱(30mx0.32mmx0.25mm)測定。頂空進樣器條件：平衡溫度80t;定量管溫度：95匸;傳輸線溫度：95°C;平衡時間：10nnin;進樣量：1.0mL。色譜條件：進樣器溫度：150°C;柱溫箱溫度：60°C;FID檢測器溫度：300°C;載氣為高純氮，柱流量50mL/min;氫氣流量50mL/min;助燃空氣流量350mL/min;清掃40mL/min;尾吹10mL/min;分流比為25：4。

　　三、結果與討論

　　3.1微生物多樣性分析

　　對污泥所包含的微生物種類及數量進行分析，按照占比排序位于前十名的微生物如圖1所示。結果表明，污泥中包含大量未經鑒定的新型微生物，約占微生物總量的30%，此外還有(按照豐度順序排列)：Syntrophobacterspp.(17.4%)，Methanobacteriumspp.(7.3%)，Geobacterspp.(1.5%)，Enterococcusspp.(0.9%)，Veilonellaspp.(0.7%)，Prevotellaspp.(0.7%)，Acinetobacterspp.(0.5%)，Desulfovibriospp.(0.3%)，Zoogloeaspp.(0.2%)和Streptococcusspp.(0.2%)„按照文獻報道，Syntrophobacter是一類互營微生物，可以在多種互營體系中降解丙酸，Methanobacterium是已知的很重要的一類產甲烷菌，可以利用乙酸或者二氧化碳產生甲烷，這可能是厭氧污泥產沼氣的重要功能微生物問，而Geobacter可以降解乙醇和乙酸等多種簡單化合物，而且可以和Methanobacterium互營生長。

　　3.2優勢功能微生物分離鑒定

　　利用梯度稀釋法從厭氧污泥中分離到了一株優勢功能微生物，將其命名為ZX—菌株。將分離的優勢功能微生物進行分子鑒定，結果顯示菌株ZX-1與已知的GeobactermetallireducensGS-15的16SrRNA基因相似度為99.4%。系統分類學結果顯示，菌株ZX-1與G.metallireducensGS-15進化關系最近(圖2)。根據文獻報道，GeobactermetallireducensGST5可以降解乙酸、乙醇和苯甲酸等多種有機物，是一種重要的功能微生物。本實驗沒有分離出污泥中豐度更高的Syntrophobacter和Methanobacterium可能是因為前者需要和其他微生物進行互營生長很難獲得純培養物而后者是產甲烷菌，需要及其苛刻的厭氧條件因而也很難分離。

　　3.3菌株ZX-1對啤酒廢水處理效果分析

　　經測定，啤酒廢水的COD約為3000mg/L，包含乙酸850mg/L，丙酸400mg/L，乙醇80mg/L和乳酸700mg/L等多種物質。為了分析菌株ZX-1對啤酒廢水的處理效果，向啤酒廢水中加入磷酸鹽和氮源(具體見材料與方法)后作為菌株ZX-1的培養基。按照10%的接種量將菌株ZX-1的種子液接入100ml新配置的培養基中，并于30°C進行培養。每天監測廢水中COD及上述各物質的含量。

　　如圖3所示，經過了1天的適應期后，啤酒廢水中的COD開始下降，10天后COD降至約1000mg/L，并維持穩定。可見菌株DX-1可去除廢水中約67%的COD„在相同的時間內，厭氧污泥對啤酒廢水COD的去除率可以高達90%，菌株ZX-1無法達到厭氧污泥的COD去除率，這可能是由于厭氧污泥中的其他微生物，女DAcinebacter和Zoogloea等，可以徹底降解丙酸和乳酸，而菌株ZX-4無法降解丙酸和乳酸導致的(數據未顯示)。

　　如圖4和圖5所示，菌株ZX-1可在十天內完全降解廢水中的乙酸和乙醇，而厭氧污泥可在5天內完全降解廢水中的乙酸和乙醇。這是由于，在厭氧污泥中，除了Geobacter菌之外，其他種類的微生物也在發揮著降解乙酸和乙醇的作用。

　　四、結論

　　(1)對該厭氧污泥的微生物群落分析結果表明，污泥中包含大約30%未經鑒定的新型微生物，此外占比超過1%的微生物類群還包括Syntrophobacter(17.4%)，Methanobacterium(7.3%)和Geobacter(1.5%)。

　　(2)從厭氧污泥中分離到了一株優勢功能微生物，命名為ZX-1o經鑒定ZX-1屬于Geobacter屬。菌種ZX-1對啤酒廢水的COD去除效率可達到67%，可徹底降解廢水中的乙酸和乙醇。(來源：廣州南沙珠江啤酒有限公司)