城市污水排放是地表水最重要的人為氮源污染之一。近年來(lái)，為了更好地調(diào)控受納水體的富營(yíng)養(yǎng)化風(fēng)險(xiǎn)，污水處理廠的總氮排放標(biāo)準(zhǔn)越來(lái)越嚴(yán)格，包括美國(guó)、歐洲和中國(guó)的部分地區(qū)甚至要求出水達(dá)到超低總氮排放限值(5~10mg·L−1)。除了溶解性無(wú)機(jī)氮(即氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮)，溶解性有機(jī)氮(DON)作為污水處理廠重要的出水氮組分越來(lái)越受到關(guān)注。特別是在無(wú)機(jī)氮脫除技術(shù)不斷提標(biāo)以及總氮排放限值愈發(fā)嚴(yán)苛的背景下，DON在污水總氮中的占比越來(lái)越高(>65%)。以往的研究表明，DON是一種潛在的生物可利用氮源，相當(dāng)一部分DON可以很容易的被藻類和細(xì)菌利用。EAM等研究發(fā)現(xiàn)DON表現(xiàn)出比無(wú)機(jī)氮更強(qiáng)的刺激浮游植物生長(zhǎng)的能力。目前常使用可以支持藻類生長(zhǎng)的DON占總DON的比例來(lái)代表DON的生物有效性，用以表征污水DON的富營(yíng)養(yǎng)化潛能。活性污泥法是污水處理廠中最廣泛應(yīng)用的技術(shù)，其中好氧活性污泥法比厭氧和缺氧活性污泥法更容易導(dǎo)致較高的出水DON濃度。因此，探討調(diào)控好氧活性污泥法中DON的技術(shù)方法，尤其是從生物有效性的角度，對(duì)于有效保護(hù)受納水體水質(zhì)具有重要的意義。

投加外源金屬二價(jià)陽(yáng)離子(如Mg2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+)可以通過(guò)影響微生物的表面電荷分布，酶活性等方式影響活性污泥系統(tǒng)的水處理能力影響出水水質(zhì)。例如，ZHANG等研究發(fā)現(xiàn)投加鎂離子(Mg2+)濃度低于1.1mmol·L−1時(shí)，好氧活性污泥硝化活性顯著提高，但在鎂離子濃度達(dá)到3mmol·L−1時(shí)硝化活性受到抑制。SINDHU等在厭氧氨氧化系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)亞鐵離子(Fe2+)添加對(duì)污泥胞外聚合物產(chǎn)量和脫氮效果有很大影響，當(dāng)添加1mmol·L−1Fe2+時(shí)，氨氮和硝態(tài)氮去除率可以分別達(dá)到94.33%和94.84%。樊艷麗等發(fā)現(xiàn)鈣離子(Ca2+)會(huì)影響活性污泥系統(tǒng)的總氮(TN)去除率。所以投加適量外源金屬離子常被用作強(qiáng)化好氧活性污泥處理性能的方法。其中，Ca2+被發(fā)現(xiàn)可以能夠影響污泥的代謝產(chǎn)物，如胞外聚合物(EPS)和微生物溶解性產(chǎn)物(SMP)。這些代謝產(chǎn)物主要是蛋白質(zhì)和多糖，與污水中的DON直接相關(guān)。ZHANG等發(fā)現(xiàn)投加168.5mg·L−1的鈣離子能夠有效減少微生物絮體中松散結(jié)合的EPS和上清液中SMP。ARABI和NAKHLA也在140mg·L−1的鈣離子投加量下發(fā)現(xiàn)了污泥上清液中SMP的降低。綜上表明，向活性污泥系統(tǒng)適量投加鈣離子具有調(diào)控出水DON的潛力。然而，目前對(duì)于鈣離子對(duì)好氧活性污泥DON的影響及內(nèi)在微生物作用機(jī)理仍不明確。

本研究旨在探究外源鈣離子對(duì)好氧活性污泥DON及其生物有效性的影響，并基于超高分辨率的傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR-MS)分析DON的分子特征，解釋其生物有效性變化的原因。最后，通過(guò)分析微生物的生理變化特征及群落結(jié)構(gòu)嘗試從微生物角度闡釋鈣離子影響好氧活性污泥DON的內(nèi)在機(jī)理。本研究的結(jié)果將為污水處理廠中好氧活性污泥法的出水DON控制提供實(shí)踐指導(dǎo)，以更好地調(diào)控出水氮的富營(yíng)養(yǎng)化潛能，降低污水排放對(duì)于水環(huán)境的負(fù)面影響。

1、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置與運(yùn)行

本研究以鈣離子濃度為外源物質(zhì)，設(shè)置鈣離子濃度水平為0.01、0.05、0.1以及1mmol·L−1為實(shí)驗(yàn)組、鈣離子濃度水平為0mmol·L−1為對(duì)照組，探究外源投加鈣離子對(duì)好氧活性污泥DON去除效果的影響。采用實(shí)際廢水(市政污水廠一級(jí)處理出水)作為進(jìn)水，本研究中進(jìn)水的COD是126.73~172.38mg·L−1、TN濃度是29.74~44.07mg·L−1、TP濃度是2.51~3.27mg·L−1、DON濃度是7.94~12.32mg·L−1。當(dāng)?shù)氐氖姓�污水廠一級(jí)出水的DON濃度也基本在5.94~13.92mg·L−1范圍內(nèi)，這表明本研究的進(jìn)水有機(jī)氮水平具有代表性。本研究通過(guò)外加CaCl2調(diào)節(jié)水中鈣離子濃度，每個(gè)濃度水平設(shè)置2個(gè)平行，搭建好氧活性污泥反應(yīng)器。監(jiān)測(cè)指標(biāo)為反應(yīng)器出水中的基本水質(zhì)參數(shù)(COD、無(wú)機(jī)氮各項(xiàng)指標(biāo)、DON)、DON分子組成以及微生物特性。反應(yīng)器運(yùn)行3個(gè)SRT后各項(xiàng)基本水質(zhì)指標(biāo)趨于穩(wěn)定。

1.2 常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)及DON濃度測(cè)定

化學(xué)需氧量(COD)采用快速密閉催化消解法測(cè)定。DON的濃度表示為總?cè)芙獾?/span>(TDN)減去所有的無(wú)機(jī)氮，包括氨氮(NH4+-N)、硝態(tài)氮(NO3−-N)和亞硝態(tài)氮(NO2−-N)。TDN測(cè)定通過(guò)過(guò)硫酸鹽消化法將樣品氧化成NO3−-N，然后采用離子色譜法定量NO3−-N的濃度。NH4+-N采用水楊酸法進(jìn)行測(cè)定。NO3−-N和NO2−-N使用離子色譜法(DionexICS-1100，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 DON生物有效性測(cè)定

首先采用14d藻類生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定可被藻類利用的DON(ABDON)。選用中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)(FACHB-collection)中被廣泛用于水體富營(yíng)養(yǎng)化表征的羊角月牙藻(Selenastrumcapricornutum)作為測(cè)試藻種。將1.5mL的藻類接種液和1mL污水廠的混合培養(yǎng)菌添加到250mL錐形瓶中的100mL污水DON樣品中。將錐形瓶置于22~25℃的溫控?fù)u床中培養(yǎng)，提供12h∶12h的光照：黑暗條件以模擬藻類生長(zhǎng)真實(shí)環(huán)境條件。用去離子水作為對(duì)照組。生物有效性的計(jì)算公式如式(1)和式(2)。

式中：ABDON代表可被藻類利用的DON濃度，mg·L−1；DONi和DONf分別代表污水樣品培養(yǎng)前后的DON濃度，mg·L−1；DONbi和DONbf分別代表去離子水樣品培養(yǎng)前后的DON濃度，mg·L−1。

1.4 DON分子特征分析

所有的污水樣品均采用PPL固相萃取柱來(lái)富集DON。在萃取之前，首先使用HPLC級(jí)的甲醇和鹽酸溶液(pH=2)活化萃取柱。然后，將酸化后的水樣(pH=2，由鹽酸調(diào)整)以2mg·min−1的流速通過(guò)PPL柱，隨后使用pH=2的鹽酸溶液沖洗柱子，并用氮?dú)獯祾吒稍铩Ｗ詈螅�使�?/span>10mL甲醇對(duì)PPL柱進(jìn)行洗脫。洗脫液用甲醇稀釋后以供進(jìn)一步FTICR-MS分析。本研究采用15TFTICR-MS(Bruker，德國(guó)布魯克光譜儀器有限公司)，配備負(fù)離子模式的電噴霧電離(ESI)源，分析樣品中DON的分子組成。用注射泵將樣品以180μL·h−1的流速注入ESI源。使用Bruker數(shù)據(jù)分析軟件(v.4.1)對(duì)原始峰進(jìn)行識(shí)別，篩選出質(zhì)量在200~700m/z范圍內(nèi)信噪比S/N>6的峰進(jìn)行分子式計(jì)算。分子式根據(jù)以下元素進(jìn)行分配：碳(C，2~50)、氧(O，0~30)、氫(H，2~120)、氮(N，0~6)、磷(P，0~2)和硫(S，0~2)。原子數(shù)量之間必須滿足2≤H≤(2C+2)、O≤(C+2)、O/C<1.2、0.333≤H/C≤2.25、N/C<0.5、S/C<0.2、P/C<0.1、(S+P)/C<0.2、P<O/3，用以排除極不可能在DON中出現(xiàn)的分子式。本研究采用不飽和等效雙鍵數(shù)(DBE)和碳的平均氧化態(tài)(NOSC)來(lái)表征DON的分子特征，計(jì)算公式如式(3)和式(4)。

1.5 微生物活性測(cè)試

本研究選擇三磷酸腺苷(ATP)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、脫氫酶(DHA)、比耗氧速率(SOUR)探究不同外源鈣離子濃度下好氧活性污泥的微生物活性。ATP濃度使用BacTiter-Glo™微生物細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。SDH活性采用琥珀酸脫氫酶活性比色測(cè)定試劑盒測(cè)定，SDH的最終濃度通過(guò)BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。DHA活性通過(guò)測(cè)量2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)還原成三苯基甲臜(TPF)的量來(lái)測(cè)定。SOUR通過(guò)使用溶解氧測(cè)量?jī)x測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)好氧活性污泥的耗氧量進(jìn)行計(jì)算。另外，本研究還通過(guò)測(cè)定微生物細(xì)胞膜上磷脂脂肪酸(PLFA)的變化知識(shí)微生物活動(dòng)的變化。PLFA分析依據(jù)NIU等提供的方法進(jìn)行，包括分離、洗脫、萃取和皂化甲基化。使用固相萃取柱分離得到磷脂，皂化甲基化后的脂肪酸甲酯采用氣相色譜儀(Agilent7890，美國(guó)安捷倫科技有限公司)測(cè)定，最后使用MIDISherlock微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

從好氧污泥反應(yīng)器中各收集3個(gè)平行的污泥樣本，使用FastDNA土壤試劑盒對(duì)s6個(gè)反應(yīng)器中的污泥進(jìn)行DNA提取。然后，DNA提取物被送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行16SrRNA基因PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化和隨后的IlluminaMiSeq測(cè)序。最后，使用Mothur軟件包(v.1.35.1)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性差異分析(單因素方差分析，ANOVA)，當(dāng)p值為<0.05認(rèn)為是差異是顯著的。冗余分析(RDA)使用CANOCO4.5軟件進(jìn)行，用以探討DON濃度及特征與微生物之間的相關(guān)關(guān)系。

2、結(jié)果與討論

2.1 DON濃度和生物有效性

通過(guò)對(duì)比5組反應(yīng)器出水DON濃度，可探究外加鈣離子對(duì)于好氧活性污泥反應(yīng)器DON去除效率的影響。由圖1可知，隨著外加鈣離子濃度的增加，反應(yīng)器出水DON的濃度表現(xiàn)出先降低后增加的趨勢(shì)。其中，空白組出水DON濃度為(2.19±0.18)mg·L−1(0mmol·L−1，Ca2+)，當(dāng)外加鈣離子濃度為0.01~1mmol·L−1，出水DON濃度為1.46~2.13mg·L−1。增效閾值的現(xiàn)象存在于外加鈣離子對(duì)于好氧活性污泥去除DON的作用中。對(duì)于本研究中設(shè)定實(shí)驗(yàn)條件，外加鈣離子對(duì)于提高好氧活性污泥反應(yīng)器DON去除效果的閾值為0.1mmol·L−1，此時(shí)出水DON濃度為1.46±0.12mg·L−1，出水DON濃度相比于空白組降低了33.3%。當(dāng)外加鈣離子濃度低于0.1mmol·L−1，隨著鈣離子濃度增加，出水DON濃度降低；當(dāng)外加鈣離子濃度高于0.1mmol·L−1，隨著鈣離子濃度增加，出水DON濃度升高。同時(shí)，對(duì)比其他基本出水水質(zhì)指標(biāo)可知，外加鈣離子在其中的增效作用閾值同樣為0.1mmol·L−1。TANG等研究在微藻-細(xì)菌共生系統(tǒng)中也觀察到相似的結(jié)果，較低的鈣離子(Ca2+)負(fù)荷(即0.1mmol·L−1)可以促進(jìn)中COD和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的去除。因此，對(duì)于基本水質(zhì)以及出水DON濃度而言，0.1mmol·L−1的外加鈣離子濃度是提高好氧活性污泥反應(yīng)器處理性能的最佳取值。

如圖2所示，出水生物DON的生物有效性與DON濃度隨外加鈣離子濃度的增加先降低后增加，也呈現(xiàn)出相似的閾值現(xiàn)象。空白組出水DON有效性為34.29%±0.06%(0mmol·L−1，Ca2+)。當(dāng)外加鈣離子濃度為從0.01mmol·L−1增加到0.1mmol·L−1時(shí)，好氧活性污泥出水的DON生物有效性從30.60%±0.05%降低至17.97%±0.05%；當(dāng)外加鈣離子濃度提高到0.1mmol·L−1時(shí)，DON的生物有效性又提高至18.54%±0.04%。生物有效性DON基于藻類生長(zhǎng)表征DON的富營(yíng)養(yǎng)化潛能，能夠更加直接地呈現(xiàn)外加鈣離子對(duì)于好氧活性污泥反應(yīng)器出水對(duì)于自然水體水質(zhì)的影響。因此上述結(jié)果表明，對(duì)于本研究的實(shí)驗(yàn)條件，基于DON的生物有效性，0.1mmol·L−1仍是外源鈣離子對(duì)于降低好氧活性污泥反應(yīng)器DON生物有效性、管控DON富營(yíng)養(yǎng)化潛能排放的最佳閾值濃度，此時(shí)DON的生物有效性相比于空白組降低了47.6%。值得討論的是，城市污水處理廠中的一般本底鈣離子濃度為30~60mg·L−1(0.75~1.5mmol·L−1)。本研究中0.1mmol·L−1的鈣離子最佳投加濃度閾值對(duì)于體系造成的改變并不算是極少的。因此，在考慮了實(shí)際污水處理廠的本底鈣離子濃度水平后，本研究中所應(yīng)用的外源鈣離子濃度仍然具有能夠顯著影響好氧活性污泥系統(tǒng)的潛力。

2.2 DON分子組成

DON的生物有效性與它的分子化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)。為了從分子層面解析外加鈣離子對(duì)好氧活性污泥反應(yīng)器出水DON生物有效性的影響，采用FTICR-MS進(jìn)一步分析DON的分子組成特征(圖3)。NOSC通常用來(lái)反應(yīng)分子的氧化還原狀態(tài)，而氧化還原狀態(tài)已經(jīng)被證實(shí)與微生物活動(dòng)密切相關(guān)。已有研究指出，低平均碳氧化態(tài)的DON分子(NOSC<0)主要包括氨基酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和不飽和烴，這些分子更容易被藻類微生物降解利用，因此是高生物有效性的組分。ZHANG等在研究中發(fā)現(xiàn)NOSC與難降解的芳香化合物(用SUVA254指示)和類腐殖酸呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這也側(cè)面證實(shí)了低NOSC的分子可能更加容易生物降解。因此，本研究選擇NOSC<0的分子代表高生物有效性的分子。

如圖3所示，不同外加鈣離子濃度下，好氧活性污泥的DON分子均主要分布在NOSC<0的高生物有效性區(qū)域。這與HUO等在A/A/O工藝中關(guān)于好氧活性污泥產(chǎn)生更多容易降解的微生物代謝DON的推測(cè)一致。韓成龍等也發(fā)現(xiàn)好氧段出水中易生物降解的DON占比更高。此外，好氧活性污泥反應(yīng)器出水中NOSC<0的DON分子數(shù)量隨外加鈣離子濃度變化的趨勢(shì)與由藻類直接測(cè)定的生物有效性變化相同，呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，且閾值同樣出現(xiàn)在0.1mmol·L−1(圖3)。空白組出水DON中位于高生物有效性區(qū)域的分子最多(0mmol·L−1，Ca2+)。當(dāng)外加鈣離子濃度在0~0.1mmol·L−1范圍內(nèi)逐漸增加時(shí)，NOSC<0的DON分子逐漸減少；當(dāng)外加鈣離子濃度大于0.1mmol·L−1時(shí)，NOSC<0的DON分子增加。因此可以合理推斷外加鈣離子通過(guò)影響好氧活性污泥反應(yīng)器中氧化程度較低的分子(NOSC<0)影響DON的生物有效性，從而調(diào)控出水DON的富營(yíng)養(yǎng)化潛能。

2.3 微生物生理生化特征及微生物群落結(jié)構(gòu)

在好氧活性污泥系統(tǒng)中，DON的去除依賴活性污泥微生物的降解與轉(zhuǎn)化作用。并且，已有研究探明，適量濃度的外加鈣離子可以增加活性污泥系統(tǒng)的TN去除能力。微生物在好氧活性污泥脫氮的過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，介導(dǎo)了外加鈣離子對(duì)于DON濃度的影響。出水DON是出水TN的重要組成部分，因此可從微生物學(xué)角度進(jìn)行闡述外加鈣離子調(diào)控DON去除過(guò)程的機(jī)理。據(jù)已有研究報(bào)道，外加鈣離子可通過(guò)改變微生物活性、馴化相應(yīng)的微生物、促進(jìn)微生物群落的演替，從而改變系統(tǒng)中微生物的水處理能力，進(jìn)而改變出水水質(zhì)。其中，微生物活性涉及微生物酶活、微生物活性物質(zhì)，或其他可指代微生物活性的相關(guān)指標(biāo)，如ATP、DHA酶活、SDH酶活、SOUR等。本研究通過(guò)分析不同外加鈣離子濃度下微生物活性的變化以及微生物群落結(jié)構(gòu)的演替，解析外加鈣離子調(diào)控DON去除過(guò)程的內(nèi)在機(jī)理。

微生物ATP測(cè)試結(jié)果如圖4(a)所示，空白組中，ATP濃度為（10.32±0.93）μg·(gMLSS)−1；實(shí)驗(yàn)組中，隨著外加鈣離子濃度逐漸升高，ATP濃度出現(xiàn)先增后減趨勢(shì)，ATP濃度分別為（12.35±0.55）μg·(gMLSS)−1(0.01mmol·L−1Ca2+)、（17.02±0.79）μg·(gMLSS)−1(0.05mmol·L−1Ca2+)、（16.62±0.21）μg·(gMLSS)−1(0.1mmol·L−1Ca2+)、（8.97±0.92）μg·(gMLSS)−1(1mmol·L−1Ca2+)。對(duì)比空白組與實(shí)驗(yàn)組結(jié)果可知，外加鈣離子對(duì)于ATP的作用同樣具有閾值效應(yīng)。ATP是為微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程提供能量的物質(zhì)，一定程度上ATP濃度的升高可表明微生物生長(zhǎng)代謝活動(dòng)的增加，因此活性污泥中ATP的濃度可指示微生物活性的高低。升高的ATP表明外加鈣離子可在一定程度上提高微生物的代謝活性。

SDH酶、DHA酶與ATP相似，是表征微生物代謝活性過(guò)程中常見(jiàn)的指示物質(zhì)。如圖4(b)所示，SDH酶濃度為(16.89±0.67)U·(mgprotein)−1(0mmol·L−1，Ca2+)、(22.01±1.08)U·(mgprotein)−1(0.01mmol·L−1，Ca2+)、(24.49±0.81)U·(mgprotein)−1(0.05mmol·L−1，Ca2+)、(26.95±2.11)U·(mgprotein)−1(0.1mmol·L−1，Ca2+)、(14.42±0.64)U·(mgprotein)−1(1mmol·L−1，Ca2+)，結(jié)果表明外源鈣離子添加濃度為0.05~0.1mmol·L−1時(shí)，SDH酶活較高、微生物代謝能力較強(qiáng)。該結(jié)果顯示的鈣離子濃度的閾值(0.1mmol·L−1)與本研究中好氧活性污泥的DON濃度和DON生物有效性所呈現(xiàn)的閾值一致。SDH酶是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，可作為評(píng)價(jià)三羧酸循環(huán)的指標(biāo)。已有研究表明生物有效性的DON包括氨基酸、脂質(zhì)等分子，而三羧酸循環(huán)作為糖類、脂類和氨基酸的最終代謝通路，能夠影響微生物對(duì)這部分DON的去除。因此SDH酶活變化一定程度上反映了出水DON生物有效性變化的原因。另外注意到，SDH酶活性與ATP濃度隨鈣離子濃度變化的趨勢(shì)類似，但外加鈣離子對(duì)于SDH酶活的閾值為0.1mmol·L−1，而對(duì)于ATP的閾值為0.05mmol·L−1，二者略有區(qū)別。這種閾值的差別可能與兩種酶在微生物代謝過(guò)程中的功能差異相關(guān)。另一方面，微生物降解污染物時(shí)，有機(jī)物在微生物細(xì)胞中的氧化作用一般通過(guò)脫氫作用獲得能量，DHA酶是微生物代謝過(guò)程發(fā)揮作用的重要生物酶。如圖4(d)所示，DHA酶在外加鈣離子濃度為0.05mmol·L−1時(shí)，具有最大活性，為（7.17±0.22）mgTF·(gMLSS)−1。總體而言，隨著外加鈣離子濃度升高，3種生物酶活性變化趨勢(shì)相近，均為活性先增加至某一閾值后降低。這表明，外加鈣離子可能通過(guò)影響與微生物代謝活動(dòng)有關(guān)的酶活性影響到DON，尤其是生物有效性DON的去除。

在現(xiàn)有研究中，常使用SOUR表示單位時(shí)間內(nèi)單位質(zhì)量活性污泥消耗氧氣的體積。在好氧活性污泥系統(tǒng)中，好氧微生物氧化有機(jī)物產(chǎn)能代謝的過(guò)程主要是以氧氣作為最終電子受體。因此相應(yīng)地，SOUR數(shù)值的大小也可直接反映好氧活性污泥系統(tǒng)中微生物活動(dòng)的變化。如圖4(c)所示，隨著外加鈣離子濃度由0.01mmol·L−1增加至0.1mmol·L−1，SOUR數(shù)值逐漸上升；當(dāng)外加鈣離子濃度增加至1mmol·L−1，SOUR數(shù)值雖略有下降，但與鈣離子濃度為0.1mmol·L−1時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(p>0.05，ANOVA)。SOUR與DON濃度和生物有效性相近的閾值現(xiàn)象也進(jìn)一步證明了外加鈣離子導(dǎo)致的DON濃度及DON生物有效性的變化與微生物代謝有機(jī)物的活性密切相關(guān)。綜上所述，一定濃度的外加鈣離子能夠提高好氧活性污泥中微生物的代謝活性，通過(guò)增強(qiáng)微生物對(duì)有機(jī)物的氧化代謝提高有機(jī)物的去除率，從而降低了好氧出水的DON。張?zhí)m河等也在研究中發(fā)現(xiàn)適量外源鈣離子的投加提高了活性污泥體系中DHA酶活性和SOUR。雖然外源鈣離子在提高微生物代謝活性的同時(shí)增加了EPS的合成，但帶正電的鈣離子可以與EPS表面帶負(fù)電的官能團(tuán)形成架橋，二者的絡(luò)合不僅提高了污泥的絮凝沉降性能，也使得松散結(jié)合型EPS的比例(LB-EPS/EPS)降低。由于LB-EPS與SMP的形成密切關(guān)聯(lián)，且SMP中由微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)等物質(zhì)又是生物有效性DON的重要組成部分，因此鈣離子與EPS的絡(luò)合作用也一定程度上支持了本研究中適量外源鈣離子促進(jìn)出水DON影響濃度及生物有效性降低的發(fā)現(xiàn)。

除了生物酶活，微生物細(xì)胞膜的組成也可以作為輔助指標(biāo)指示微生物活性的變化。PLFA是微生物細(xì)胞膜磷脂雙分子層的主要組成部分，多存在于活性微生物中，微生物死亡后PLFA會(huì)被迅速降解。并且PLFA可進(jìn)一步分類為飽和脂肪酸(SFA)、不飽和脂肪酸(UFA)、異構(gòu)脂肪酸(IFA)和反式異構(gòu)脂肪酸(AFA)。圖5展示了不同外加鈣離子濃度對(duì)微生物細(xì)胞膜的影響。結(jié)果表明，5組反應(yīng)器中，飽和脂肪酸(SFA)在細(xì)胞膜組成中相對(duì)豐度由大到小為：外加鈣離子濃度為0.1mmol·L−1時(shí)(69.91%)>外加鈣離子濃度為0.05mmol·L−1時(shí)(64.79%)>外加鈣離子濃度為1mmol·L−1時(shí)(62.35%)>外加鈣離子濃度為0.01mmol·L−1時(shí)(56.40%)>空白組(55.37%)。不飽和脂肪酸(UFA)在細(xì)胞膜組成中相對(duì)豐度由大到小為：空白組(28.79%)>外加鈣離子濃度為0.01mmol·L−1時(shí)(26.58%)>外加鈣離子濃度為0.05mmol·L−1(24.95%)>外加鈣離子濃度為1mmol·L−1時(shí)(22.79%)>外加鈣離子濃度為0.1mmol·L−1時(shí)(20.69%)。細(xì)胞膜組成中的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜流動(dòng)性的重要指標(biāo)。已有研究報(bào)道，微生物在環(huán)境影響下會(huì)自發(fā)改變細(xì)胞膜PLFA組成，通過(guò)調(diào)節(jié)飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸在細(xì)胞膜中的占比調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性。基于不同外加鈣離子濃度下好氧活性污泥反應(yīng)器中DON濃度的變化結(jié)果，外加鈣離子濃度為0.1mmol·L−1為提高好氧活性污泥反應(yīng)器去除DON效率的最佳取值。當(dāng)外加鈣離子濃度為0.1mmol·L−1時(shí)細(xì)胞膜飽和脂肪酸占比最高(64.79%)，不飽和脂肪酸(20.69%)和反式異構(gòu)脂肪酸占比最低(5.12%)。在微生物細(xì)胞膜組成中，反式異構(gòu)脂肪酸具有與不飽和脂肪酸相同的作用，通過(guò)破壞磷脂酰基鏈的緊密堆積從而改變細(xì)胞膜流動(dòng)性。因此，反式異構(gòu)脂肪酸在細(xì)胞膜中相對(duì)豐度增加，會(huì)提高細(xì)胞膜流動(dòng)性。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞膜的流動(dòng)性極大地影響了微生物胞內(nèi)許多與結(jié)構(gòu)或功能無(wú)關(guān)的化合物的運(yùn)輸和排出，這可能對(duì)微生物代謝的DON產(chǎn)物的釋放產(chǎn)生重要影響。MA等研究表明細(xì)胞流動(dòng)性越低，出水蛋白質(zhì)含量越低。在本研究中，出水DON濃度和生物有效性最低時(shí)(外加鈣離子濃度為0.1mmol·L−1)，細(xì)胞膜組成的分析結(jié)果都表明了細(xì)胞膜組成轉(zhuǎn)變?yōu)榱鲃?dòng)性更低的狀態(tài)，這可能阻滯了微生物代謝產(chǎn)生的DON的排放，從而使得在該濃度下能達(dá)到最佳的出水DON排放濃度和生物有效性。

微生物群落結(jié)構(gòu)是影響好氧活性污泥系統(tǒng)水處理效果的重要因素之一。因此，對(duì)比5組反應(yīng)器在不同外加鈣離子濃度下微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，可進(jìn)一步解析最優(yōu)鈣離子投加條件下(外加鈣離子濃度為0.1mmol·L−1)促使DON去除效率最高的原因。圖6展示了5組反應(yīng)器在穩(wěn)定期微生物群落在屬水平的分布。除尚無(wú)對(duì)應(yīng)分類名錄的菌種外，在屬水平上的主要微生物菌種(按照5組反應(yīng)器中相對(duì)豐度值由大到小)為Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、Propionicicella、Luteolibacter、Ferruginibacter、Defluviimonas、Dechloromonas、Rhodoferax、Blastocatella、Sphingorhabdus、Ferribacterium等。其中值得注意的是，Luteolibacter為微生物群落中發(fā)揮降解有機(jī)物作用的好氧菌，是指示微生物群落對(duì)有機(jī)物去除能力的重要菌種。對(duì)比不同外加鈣離子濃度下Luteolibacter菌的相對(duì)豐度變化可知，當(dāng)外加鈣離子濃度由0.01mmol·L−1增加至0.1mmol·L−1時(shí)，Luteolibacter菌相對(duì)豐度由2.07%富集至7.44%；當(dāng)外加鈣離子濃度由0.1mmol·L−1增加至1mmol·L−1時(shí)，Luteolibacter菌相對(duì)豐度下降至3.56%。這說(shuō)明Luteolibacter菌在鈣離子調(diào)控的環(huán)境下，其存活狀態(tài)同樣具有生存閾值，在一定范圍內(nèi)，外加鈣離子可通過(guò)富集時(shí)Luteolibacter菌強(qiáng)化系統(tǒng)對(duì)有機(jī)物去除的能力，從而提高DON去除率。一定程度而言，在外加0.1mmol·L−1鈣離子調(diào)控好氧活性污泥系統(tǒng)的DON去除過(guò)程中，Luteolibacter菌扮演著不可忽視的作用。因此，外源鈣離子可能通過(guò)調(diào)整微生物群落結(jié)構(gòu)，尤其是提高降解有機(jī)物的好氧菌的相對(duì)豐度，強(qiáng)化對(duì)于好氧活性污泥反應(yīng)器中DON的去除。

進(jìn)一步地，為揭示在外源鈣離子調(diào)控下，出水DON濃度-出水DON生物有效性-微生物生理生化特性和群落結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)關(guān)系，使用RDA對(duì)前述結(jié)果(出水DON濃度、DON生物有效性、微生物生理生化特性、微生物群落結(jié)構(gòu))進(jìn)行深入分析，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，RD1與RD2分別代表了62.4%與10.9%的總差異，對(duì)于原始數(shù)據(jù)解釋度大于70%，表明通過(guò)冗余分析，原始數(shù)據(jù)中的變化規(guī)律即相關(guān)關(guān)系仍然得到了較為完整的數(shù)據(jù)保留，并在一定程度上有映射到RDA二維分析圖中。DON和ABDON濃度與外源添加鈣離子濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，這再一次地證明了，外源添加鈣離子對(duì)于提高DON去除率、降低DON生物有效性具有積極作用。在外源鈣離子的調(diào)控下，5組反應(yīng)器對(duì)應(yīng)的樣點(diǎn)表現(xiàn)出顯著的組內(nèi)聚類以及組外分離現(xiàn)象。該現(xiàn)象表明，在鈣離子的作用下，5組反應(yīng)器在微生物生理生化特性和群落結(jié)構(gòu)方面表現(xiàn)出一定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，這種差異與鈣離子濃度以及出水DON濃度之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性。因此，綜合外源鈣離子濃度、出水DON濃度、出水DON生物有效性、微生物生理生化特性、微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，冗余分析進(jìn)一步解釋了在外加鈣離子調(diào)控好氧活性污泥系統(tǒng)中DON去除過(guò)程中，微生物扮演了重要的介導(dǎo)傳遞作用。

3、結(jié)論

1)外加鈣離子對(duì)于好氧活性污泥系統(tǒng)去除DON的調(diào)控效果具有積極作用，但其強(qiáng)化系統(tǒng)DON去除能力的作用具有閾值。外源鈣離子投加最佳取值為0.1mmol·L−1，在此條件下，可進(jìn)一步降低33.3%的出水DON濃度，降低DON生物有效性47.6%。

2)DON分子組成分析得到的最佳鈣離子投加條件與DON生物有效性一致，表明外加鈣離子是通過(guò)影響好氧活性污泥反應(yīng)器中氧化程度較低分分子(NOSC<0)影響了出水DON的生物有效性，從而調(diào)控出水DON的富營(yíng)養(yǎng)化潛能。

3)微生物學(xué)分析表明，在外源鈣離子最佳取值的條件下，系統(tǒng)中ATP、SDH酶、DHA酶這類與微生物代謝密切相關(guān)的生物酶活達(dá)到較高水平，使得微生物對(duì)于有機(jī)物降解代謝能力有效提高。同時(shí)，微生物細(xì)胞膜中飽和脂肪酸相對(duì)豐度增加至64.79%，有效降低細(xì)胞膜流動(dòng)狀態(tài)，減少了微生物代謝DON的排放。微生物群落中發(fā)揮有機(jī)物降解作用的Luteolibacter菌在外源鈣離子最佳取值的條件下富集至7.44%，是推動(dòng)DON去除率提升的重要因素。

4)冗余分析表明了不同外加鈣離子濃度下好氧活性污泥微生物在生理特征和群落結(jié)構(gòu)上的顯著差異，再次闡明了微生物在影響出水DON濃度和生物有效性過(guò)程中的重要介導(dǎo)作用。（來(lái)源：南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中持新概念環(huán)境發(fā)展宜興有限公司）