1 引言(Introduction)

　　近年來, 隨著中國經濟迅速發展, 紡織印染行業也逐漸壯大, 有關研究報告稱, 世界染料總產量超過80萬t·a-1, 種類超過10萬種, 中國年產量占世界年產量的40%, 而且每年以30%的比例持續增長(Fan et al., 2009).偶氮染料不僅種類繁多, 而且應用廣泛.目前, 偶氮染料已被廣泛應用于紡織印染、食品、造紙印刷等行業(Ulson de Souza et al., 2007), 占總紡織染料使用量的70%左右(Lang et al., 2013), 是各行業中應用最為廣泛的一類合成染料.

　　含有偶氮鍵的染料統稱為偶氮染料, 是染料中最多的一類.以雜環化合物作為重氮組分或偶合組分的偶氮染料, 主要有分散染料、酸性染料和活性染料.偶氮染料色彩鮮艷、分子吸光系數大、牢度較好, 是當前分散、酸性染料、活性染料的主要發展方向.一般說來, 偶氮化合物的分子中含有1~3個“―N=N―”, 鍵上連有苯或苯基, 苯或苯基又連有―Cl、―NH2、―CH3、―SO3、―NO2及―OH等基團(Saratale et al., 2011).偶氮分子的發色基是偶氮鍵, 助色基是氨基、羥基、甲基和磺酸基等, 當光線射入后發生選擇性吸收而產生視覺所感受到的各種顏色.偶氮染料的使用量在紡織印染行業最大, 產生的紡織印染廢水量也最多.含偶氮染料的紡織印染廢水具有色度高、化學穩定性強和生物可降解性差的特點(Supaka et al., 2004), 而且其本體及其降解產物苯胺類中間體具有毒性、致突變和致癌性(Pandey et al., 2007), 是國內外公認的難處理的廢水之一.這些有毒物質長期存在于水環境中, 對人類及動植物的健康會造成極大危害(Lima et al., 2007), 因而篩選能夠高效降解偶氮染料的微生物, 并將其應用到印染廢水的處理已經成為國內外研究的熱點之一.

　　國內外研究人員已發現了多種微生物對偶氮染料有較強的脫色能力, 細菌、真菌、酵母菌、藻類及某些植物都被檢測到可以降解或礦化各種染料使其脫色.偶氮染料分子的發色基是偶氮鍵(—N=N—), 偶氮染料的脫色是通過偶氮鍵斷裂來實現(Nam et al., 2000).一般認為, 微生物并不能把大分子偶氮染料當作基質吸收利用, 而是通過合成一種特定的偶氮還原酶, 在其催化作用下將發色基團偶氮鍵還原成無色的胺類物質(嚴濱等, 2008; dos Santos et al., 2007).脫色細菌因其在環境中普遍存在, 培養條件簡單, 繁殖迅速, 在工業微生物領域應用廣泛而被高度重視.例如, Dawkar等(2009)報道的偶氮染料脫色細菌Bacillus sp. VUS, 在18 h的脫色過程中, 可以對50 mg·L-1的偶氮染料Navy Blue 2G進行有效脫色, 且脫色率達到94%;Jadhav等(2008)報道的偶氮染料脫色細菌Comamonas sp. UVS, 在13 h的脫色過程中, 可以對1.1 g·L-1的偶氮染料Direct Red 5B進行有效脫色, 且脫色率高達到100%;Kalyani等(2009)報道的偶氮染料脫色菌Pseudomonas sp. SUK1, 在6 h的脫色過程中, 可以對高濃度(5 g·L-1)的偶氮染料Reactive Red 2進行有效脫色, 且脫色率達到96%;Saratale等(2009)報道的Micrococcus glutamicus NCIM-2168, 在42 h脫色過程中, 可以對50 mg·L-1的偶氮染料Reactive Green 19 A進行有效脫色, 且脫色率達到100%;Amar等(2008)報道的 Rhizobium radiobacter MTCC 8161, 在48 h脫色過程中, 可以對50 mg·L-1的偶氮染料Reactive Red 141進行有效脫色, 且脫色率達到90%.但關于嗜水氣單胞菌屬(Aeromonas hydrophila)對偶氮染料酸性橙7的脫色研究鮮有報道.

　　因此, 本實驗利用平板劃線分離法從杭州七格污水處理廠二沉池的活性污泥中篩選得到一株對偶氮染料酸性橙7(Acid Orange 7)具有高效脫色功能的菌株嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila strain JL-1), 通過16S rRNA基因序列分析鑒定, 并初步探討該菌株的最佳脫色條件及其脫色性能, 為進一步豐富高效偶氮脫色菌的基因庫, 進行印染工業廢水的處理及偶氮染料降解機理的研究提供參考依據.

　　2 材料與方法(Materials and methods)2.1 偶氮染料

　　酸性橙7(Acid Orange 7, 簡稱AO7), 又稱為金橙Ⅱ(OrangeⅡ), CAS號633-96-5, 分子式為C16H11N2NaO4S, 相對分子為350.32, 特征波長λmax=484 nm, 分子結構示意圖如圖 1所示.本產品購置于杭州某化學藥劑公司, 純度>85%, 屬于偶氮酸性染料, 主要用于酸堿指示劑、生物染色劑、抽提和分光測定陽離子表面活性劑.

　　圖 1

　　圖 1酸性橙7(AO7)分子結構示意圖

　　2.2 培養基

　　選用LB培養基(Luria-Bertani medium)用于菌株的培養, 再選取另外5種不同類型培養基用于菌株的脫色實驗, 其培養基組成成分如表 1所示.所使用的培養基均由50 g·L-1的NaHCO3溶液調節pH至7.0, 并在121 ℃下滅菌20 min, 待培養基降到60 ℃后, 加入偶氮染料AO7.

 　　2.3 16S rRNA基因測序

　　菌體在液體培養基培養至對數期, 取1 mL菌液，使用上海申能博彩生物科技有限公司生產的3S柱離心式環境樣品DNA抽提試劑盒提取總DNA.擴增菌株16S rRNA基因, 使用細菌通用引物對(正向引物27F 5′-AGAGTTYGATCCTGGCTCAG-3′; 反向引物1492R 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′).PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min; 95 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min 30 s, 30個循環; 72 ℃保溫10 min, 4 ℃保存.將測序所得基因序列提交至NCBI數據庫，使用BLAST進行同源性比對, 并下載相關序列, 利用系統發育樹分析軟件MEGA5.0計算序列相似度, 同時用其中的Neighbor Joining(NJ)方法構建菌株的系統發育樹并對序列進行親緣性及系統發育分析.

　　2.4 脫色實驗

　　配置100 mL含有100 mg·L-1偶氮染料AO7的培養基于250 mL的錐形瓶中, 按6%的接種量接種菌株JL-1(接種液OD600=1.5), 在溫度為30 ℃、轉速為150 r·min-1的恒溫振蕩器中進行接種培養24 h.探討環境條件對菌株JL-1脫色性能及其生長情況的影響, 包括初始染料濃度(20、50、100、150和200 mg·L-1)、接種量(2%、4%、6%、8%和10%)、pH(5、6、7、8和9)和NaCl濃度(0、5、10、30和50 g·L-1).

　　2.5 分析方法

　　使用721可見分光光度計對偶氮染料AO7與菌株JL-1進行定量分析, 分析方法參照文獻(Chen, 2002).所取混合樣品一部分直接在600 nm的波長下測定吸光度OD(optical density), 另一部分經10 min、13000 r·min-1離心(H1850R臺式高速冷凍離心機), 上清液在波長600 nm和λmax=484 nm下分別進行吸光度測定, 菌株濃度用樣品離心前(式(1))、后(式(2))混合液在600 nm下的吸光度的差值表征, 染料濃度用樣品離心后上清液在λmax下的吸光度表征(式(3)).

　　式中, OD600X+dye為樣品混合液在600 nm下吸光度值; OD600X為細菌菌液在600 nm下吸光度值, 用于表征細菌濃度; OD600sup與OD600dye為樣品上清液在600 nm下染料的吸光度值; ODλmaxsup與ODλmaxdye為樣品上清液在最大吸收波長下染料的吸光度值;

　　用脫色率表征菌株JL-1對染料AO7的脫色能力(吸附與降解能力), 根據公式(4)計算脫色率η.

　　式中, OD0為培養基初始的吸光度值; OD1為反應一段時間后的吸光度值.

　　3 結果與討論(Results and discussion)3.1 菌株的分離篩選

　　采用平板劃線分離法從杭州七格污水處理廠二沉池的活性污泥中篩選得到一株對偶氮染料酸性橙7(AO7)具有高效脫色功能的菌株, 編號為JL-1.該菌株在LB瓊脂培養基上生長良好, 兼性厭氧, 形成邊緣整齊、表面濕潤、光滑的圓形菌落, 菌落呈半透明、灰白色, 有特殊氣味, 菌落的大小與培養時間、溫度有關, 菌落小的只有針尖大小, 大的直徑可達3~4 mm, 菌落照片如圖 2所示.

　　圖 2

　　圖 2菌株JL-1菌落照片

　　3.2 菌株的16S rRNA序列分析

　　測序獲得菌株JL-1的16S rRNA基因序列(1153 bp), 將測序獲得的正反序列經RNAMAN序列拼接后, 在NCBI數據庫中進行同源性比對, 獲得Blast序列登錄號為XMACAS5301R.選取Blast中已有的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)序列相近的標準菌株, 并下載相關序列, 利用軟件MEGA5.0計算序列相似度, 同時用其中的Neighbor Joining(NJ)方法構建菌株的系統發育樹并對序列進行親緣性及系統發育分析.該菌株的16S rRNA基因序列的系統發育樹如圖 3所示.結果表明, 菌株JL-1基因與Aeromonas hydrophila strain S5-14相似度最高, 同源性高達99%.并且在所構建的系統發育樹中, 菌株JL-1與Aeromonas hydrophila strain S5-14也處于同一分支上, 因此, 結合其形態特征, 將該菌鑒定并初步命名為Aeromonas hydrophila strain JL-1.

　　圖 3

　　圖 3菌株JL-1的16S rRNA基因序列系統發育樹(括號內序號為Blast登錄號, 數字為同源性)

　　3.3 培養基對菌株脫色性能的影響

　　由圖 4可知，菌株JL-1對100 mg·L-1偶氮染料酸性橙7(AO7)脫色因選用培養基不同而脫色率各異, 在10 h脫色過程中, Czapek′s medium、Martin Broth、Mineral salt medium、M9 medium、Sabourand medium 5種培養基的脫色率達不到40%, 而Luria-Bertani medium的脫色率高達94.7%.究其原因, 可能是因為Luria-Bertani medium所含營養物質(胰蛋白胨、酵母浸膏)均是復雜的有機含氮化合物, 能提供菌株生長所需的碳源和氮源, 而且酵母浸膏作為合作基質可以促進偶氮染料脫色(Muhammad et al., 2016), 但其余5種培養基所含的營養物質均為無機氮源, 不利于菌株JL-1對偶氮染料AO7脫色.因此, 在后續的實驗中, 選擇Luria-Bertani medium作為偶氮染料的脫色培養基.

　　圖 4

　　圖 4培養基對菌株JL-1脫色性能的影響(a.Czapek′s medium, b.Martin Broth, c.Mineral salt medium, d.M9 medium, e.Sabourand medium, f. Luria-Bertani medium)

　　3.4 初始染料濃度對菌株脫色性能及生長的影響

　　本實驗為了探討菌株JL-1對偶氮染料AO7的脫色能力, 設計了5組不同初始AO7濃度的LB脫色培養基, 用于觀察初始染料濃度對菌株脫色性能及其生長的影響.菌株JL-1對不同濃度的偶氮染料AO7脫色情況如圖 5a所示, 增殖情況如圖 5b所示.圖 5a表明, 在10 h脫色過程中, 菌株JL-1對偶氮染料AO7的脫色效果受初始染料濃度的影響, 對于低濃度(20 mg·L-1)和中低濃度(50 mg·L-1)的偶氮染料AO7, 菌株JL-1在4 h內完成78.3%和88.7%的脫色, 在后續6 h脫色過程中脫色率幾乎沒有變化; 對于中等濃度(100 mg·L-1)的偶氮染料AO7, 菌株JL-1在8 h內完成93.8%的脫色, 在后續2 h培養過程中脫色率幾乎沒有變化; 對于中高濃度(150 mg·L-1)和高濃度(200 mg·L-1)的偶氮染料AO7, 菌株JL-1在10 h內只完成84.7%和68.3%的脫色.當初始染料濃度在20~100 mg·L-1之間時, 菌株JL-1的脫色效率隨著AO7濃度增加而增加, 初始染料濃度在100~200 mg·L-1之間時, 菌株JL-1的脫色效率隨著AO7濃度增加而減小.圖 5b表明, 在前4 h培養過程中, AO7濃度對菌株JL-1的生長沒有明顯影響, 在后6 h培養過程中, 隨著初始染料AO7濃度的升高, 其OD600值增加幅度逐漸減小, 在高濃度(200 mg·L-1)的AO7環境下生長的菌株增殖速率下降最快.

　　圖 5

　　圖 5初始染料濃度對菌株JL-1脫色(a)及生長(b)的影響

　　菌株JL-1對100 mg·L-1偶氮染料AO7在8 h的脫色率達到93.8%, 相比于Tan等(2013;2014;2016)研究中所述降解20 mg·L-1偶氮染料AO7的脫色菌株, 菌株JL-1的脫色能力與效率明顯均要高于前者.Chen(2003)研究的菌株Aeromonas hydrophila DEC1對100 mg·L-1偶氮染料AO7在24 h的脫色率達到79%, 其脫色菌株DEC1與菌株JL-1均屬于嗜水氣單胞菌屬, 但針對同一濃度(100 mg·L-1)偶氮染料AO7的降解, 其脫色效率要比菌株JL-1遜色許多.

　　脫色菌株JL-1對于各種濃度梯度的偶氮染料AO7均達不到100%脫色, 而且低濃度AO7染料脫色會受到抑制, 隨著初始染料濃度越高, 脫色速率會越小, 抑制現象也越明顯, 脫色到一定程度后將很難再進行下去.探究其原因可能是本體偶氮染料及其分解產生的具有毒性的中間體抑制了脫色菌株生長和偶氮還原酶合成(Tony et al., 2009; Jadhav et al., 2011), 使得其脫色能力下降, 圖 5b的菌株增殖趨勢也證實這一點, 隨著初始偶氮染料AO7濃度的增加, 菌株JL-1的增殖速率在不斷下降, 偶氮染料AO7會抑制菌株的生長.在偶氮染料誘導之下, 脫色菌被誘導合成偶氮還原酶, 將AO7分解成對氨基苯磺酸和1-氨基-2-萘酚(García-Martínez et al., 2015).染料濃度越高, 分解的代謝產物量將越多, 對菌株活性的抑制也更強, 脫色率下降將顯而易見.因此, 本實驗選取100 mg·L-1偶氮染料AO7作為菌株JL-1最佳脫色的初始染料濃度.具體聯系污水寶或參見http://m.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　3.5 接種量對菌株脫色性能及生長的影響

　　菌體初始接種量的大小不僅直接影響生物脫色效率, 而且與工程應用的成本息息相關.為了保證染料有效脫色, 同時又能把成本降到最低, 本實驗設置了一系列的接種量用于探討pH對菌株JL-1脫色性能及生長的影響.不同接種量的菌株JL-1對100 mg·L-1偶氮染料酸性橙7(AO7)脫色情況如圖 6a所示, 生長情況如圖 6b所示.在8 h的脫色過程中, 接種量為2%時的脫色率僅為68.7%, 接種量為4%時的脫色率為77.3%, 接種量為6%時的脫色率為80.5%, 接種量為8%時的脫色率達到90.8%, 接種量為10%時的脫色率達到92.7%.結果表明, 菌株JL-1的脫色效率受接種量大小的影響, 接種量越大, 菌株生長速率越快, 脫色效果也越好.菌株JL-1以二分裂方式增殖, 接種量越大, 菌體的初始濃度也將越高, 其脫色率和增殖速率也會越高(Tuttolomondo et al., 2014), 為了保證脫色效果, 接種量至少應為8%, 這與Tan等(2014)得出的結論相吻合.因此, 本實驗選取8%的接種量作為菌株JL-1的最佳接種量.

　　圖 6

　　圖 6接種量對菌株JL-1脫色(a)及生長(b)的影響

　　3.6 pH對菌株脫色性能及生長的影響

　　考慮到紡織印染廢水pH值較高, 本實驗設置了5組pH梯度用于探討pH對菌株JL-1脫色性能及生長的影響.所處不同pH環境下的菌株JL-1對100 mg·L-1偶氮染料酸性橙7(AO7)的脫色情況如圖 7a所示, 生長情況如圖 7b所示.在8 h的脫色過程中, pH為5的培養基脫色率達到92.1%, pH為6的培養基脫色率達到91.6%, pH為7的培養基脫色率達到75.9%, pH為8的培養基脫色率達到69.2%, pH為9的培養基脫色率僅有29.1%.結果表明, 菌株JL-1更適合在偏酸性環境對偶氮染料AO7進行脫色, 在偏堿性環境下它的生長與脫色都會受到抑制(于文娟等, 2012).這一結論與Chen等(2003)報道的嗜水氣單胞菌在偏酸性環境對活性深藍NR脫色結果相似.因此, 本實驗選取pH為5的偏酸性環境作為菌株JL-1的最佳脫色環境.

　　圖 7

　　圖 7 pH對菌株JL-1脫色(a)及生長(b)的影響

　　微生物對染料的脫色主要是通過生物吸附和生物降解兩個過程實現, 這兩個過程與pH值的大小密切相關, 它不僅可以改變染料結構和電荷而影響微生物細胞對染料的吸附(Wang et al., 2008), 而且還可以通過改變脫色菌合成的偶氮還原酶活性間接影響脫色效率.在偏酸性的環境下, 偶氮染料AO7的磺酸基更容易與H+結合, 使得偶氮染料AO7分子間產生靜電斥力, 從而促進微生物細胞對染料的吸附作用(Konsowa et al., 2011; Qu et al., 2010); 在偏堿性環境下, 較高的pH值會使得菌株JL-1產生偶氮還原酶失去活性, 從而影響到菌株的脫色效率.

　　3.7 鹽度對菌株脫色性能及生長的影響

　　考慮到紡織印染廢水具有很高的含鹽量, 因此, 本實驗設置5組含有不同NaCl濃度梯度的LB培養基, 用NaCl含量表示鹽度的高低, 探討鹽度對菌株JL-1脫色性能及生長的影響.所處不同鹽度環境下的菌株JL-1對100 mg·L-1偶氮染料酸性橙7(AO7)的脫色情況如圖 8a所示, 生長情況如圖 8b所示.在10 h的脫色過程中, 未加NaCl(即鹽度為0)的培養基脫色率僅有63.1%, NaCl濃度為5 g·L-1(鹽度為5%)的培養基脫色率達到76.7%, NaCl濃度為10 g·L-1(鹽度為10%)的培養基脫色率達到93.6%, NaCl濃度為30 g·L-1(鹽度為30%)的培養基脫色率僅有55.5%, NaCl濃度為50 g·L-1(鹽度為50%)的培養基脫色率僅有20.2%.顯而易見, 過低或過高濃度的NaCl都會影響菌株JL-1的脫色效果, 在NaCl濃度較低(0~10 g·L-1)時, 菌株JL-1對偶氮染料AO7的脫色能力隨著NaCl濃度升高而加強, 這與Gou等(2009)發現鹽度從0增加到6%時青霉菌QQ對偶氮染料活性深紅X-3B脫色效果明顯增強的現象一致; 在NaCl濃度較高(10~50 g·L-1)時, 菌株JL-1對偶氮染料AO7的脫色能力隨著NaCl濃度升高而減弱, NaCl濃度為10 g·L-1的培養基脫色效果最佳.推測其原因可能是菌株JL-1在高濃度NaCl的培養基里活性受到抑制, 鹽析作用增強, 脫氫酶的活性下降, 微生物本身活性受阻, 新陳代謝作用減緩, 導致脫色率下降.這一推測也從圖 8b得到證實, 菌株JL-1在NaCl濃度為50 g·L-1的培養基里的OD600值達不到1.2, 明顯低于其他NaCl濃度下的OD600值, 表明菌株JL-1在高鹽度條件下的生長受到抑制.另外, 脫色菌JL-1合成的偶氮還原酶活性高低將直接影響偶氮染料的脫色效率, 鹽度過高會使得偶氮還原酶變性.因此, 本實驗選取NaCl濃度為10 g·L-1的低鹽度環境作為菌株JL-1的最佳脫色環境.

　　圖 8

　　圖 8 NaCl濃度對菌株JL-1脫色(a)及生長(b)的影響

　　事實上, 鹽度對微生物細胞的滲透壓有極大影響, 高鹽度環境會抑制細菌生長, 甚至導致細胞死亡(Kolekar et al., 2008).染料的制造和印染工序產生的廢水鹽度一般在15%~20%之間(Manu et al., 2003), 一般來說, NaCl濃度超過3 g·L-1就可以對大多數細菌活性造成中等程度的抑制(郭建博等, 2007; 鄒聰慧等, 2011; Nachiyar et al., 2007; Gou et al., 2010).然而, 菌株JL-1在NaCl濃度為10 g·L-1條件下生長良好, 對偶氮染料AO7的脫色率高達93.6%, 不存在抑制現象, 由此可見, 菌株JL-1具有一定程度的耐鹽性.

　　4 結論(Conclusions)

　　1) 采用平板劃線分離法從杭州七格污水處理廠二沉池的活性污泥中篩選得到一株對偶氮染料酸性橙7具有高效脫色功能的細菌, 編號為JL-1, 根據16S rRNA基因序列分析結果, 鑒定并命名為Aeromonas hydrophila strain JL-1.

　　2) 菌株JL-1可在缺氧振蕩培養條件下對偶氮染料酸性橙7 (Acid Orange 7)進行脫色; 培養基、初始染料濃度、接種量、pH和NaCl濃度對菌株JL-1脫色性能及生長有明顯影響; pH為5.0、鹽度為10%、溫度為30 ℃、轉速為150 r·min-1的LB培養基(Luria-Bertani medium)為菌株JL-1最佳的脫色及生長環境, 在此環境條件下, 100 mg·L-1的偶氮染料AO7脫色率達95%以上.該菌株耐鹽性良好, 能在高達30%鹽度下對染料進行有效的脫色.(來源：環境科學學報 作者：焦亮)