1 引言(Introduction)

　　人類活動帶來的水體富營養化的問題(馬經安等，2002)，使人們越來越關注氮和磷(蔡順智等，2016)在自然界中的遷移轉化，尤其是氮的去除率已經成為衡量某一自然或人工系統脫氮效果的重要指標.污水處理廠在設計之初，就將利于硝化和反硝化作用的發生作為重要的設計指標(傅鋼等，2004).但是脫氮效率不穩定，脫氮效果不達標的現象在水處理過程中經常發生(張雷等，2014).脫氮過程，即氨氮經過硝化作用生成硝酸氮和亞硝酸氮，硝酸氮和亞硝酸氮再經過反硝化過程被轉化為氮氣進入空氣，最終達到脫氮的目的的過程(Ye et al., 2001).通常所說的氮去除效率不達標只是表面現象，實質上，是活性污泥沒有達到期望的處理能力.在自然水體或復雜水工構筑物中，很難通過簡單的氮含量測定來描述該生態或生物系統的脫氮性能(盧陽陽，2013)，因此，從活性污泥入手建立一種檢測方法或者指標來評價微生物的脫氮性能，并能根據其變化來反饋污水處理過程中的脫氮情況，將對污水處理廠脫氮效能的準確把握與精準調控意義重大.

　　基于同位素分餾效應(Banner et al., 1995)，穩定同位素檢測為水中氮素的遷移轉化過程(Hoefs et al., 1997)研究提供了技術方法.Handley和Raven(1992)在1992年，就將同位素分餾效應用于解釋硝化反硝化過程中的物質遷移轉化，Barford等(1999)，Karen等(2003)和Lehmann(2004)也對此開展了進一步研究，得出在硝化與反硝化過程中均存在著明顯的同位素分餾效應，使得液相中無機氮的氮同位素比值上升.隨著活性污泥同化作用的發生，其δ15N值隨液相無機氮δ15N值的升高而升高.所以，脫氮效果不佳，就意味著δ15N值下降.

　　為研究城市污水廠活性污泥的脫氮效果，實際中通常監測TN、NH4-N、NO3-N等指標，并結合MLSS、MLVSS、SS、SVI等指標來監測活性污泥生長情況.這些指標只能單一的反映水質或微生物的某一項變化，當城市污水廠出現脫氮問題時，需要對水質和污泥分別進行監測才有可能找出問題所在，這些指標不能很好地反映活性污泥中與脫氮相關的微生物群落狀況.然而，面對一些復雜的脫氮疑難問題時，需結合微生物狀況分析，但這些方法一般費時費力，如凝膠電泳法用時達一周.針對這一問題，本研究旨在開發一種既能反映活性污泥的實際脫氮性能，又能表征活性污泥中與脫氮相關的的微生物群落狀況的檢測方法.本文利用瑞利分餾方程建立了關于活性污泥δ15N值與污水中無機氮的去除效率之間的關系模型(活性污泥脫氮效率模型)，該模型的核心就是通過活性污泥本身的δ15N值來預測其脫氮性能.為確定該模型中的相關參數，對某A2O工藝的污水處理廠進行長期監測，并應用于具有不同出水特性的污水處理廠，以證明該模型在不同無機氮組成情況下的適用性.最后，本文還設置了幾種典型工況，以證明該模型在不同工況下的適用性.該模型的建立，簡化了對水處理系統復雜的布點監測程序，對污水處理廠的強化脫氮具有指導意義，為水處理系統脫氮性能評價提供了新的手段.本研究提出的檢測方法意在通過監測活性污泥的δ15N值，實現對污水廠脫氮效率的預測，同時表征活性污泥的脫氮活性.與常規監測方法不同，本方法只需取少量污泥，進行一定的預處理后送檢即可計算出污泥脫氮效率及脫氮活性.該方法在污水處理廠的調試過程或分析脫氮問題遇到瓶頸時，可以提供借鑒作用，具有一定的實用價值.

　　2 材料與方法(Materials and methods)2.1 樣品

　　本實驗所用樣品分別取自陜西省西安市第三、第四及第五污水處理廠.西安市第三污水處理廠采用Orbal氧化溝工藝，轉碟曝氣，有效水深4.2 m，生物池總HRT為18 h，SRT為20 d.西安市第四污水處理廠采用內嵌氧化溝倒置A2O二級生物處理工藝，微孔曝氣，有效水深6.0 m，HRT為11 h (其中缺氧池1.98 h，厭氧池1.0 h，內嵌氧化溝的好氧池7.94 h)，SRT為24 d.第五污水處理廠一期污水處理規模20×104 m3·d-1，采用厭氧/缺氧/好氧(A2O)二級生物處理工藝，3個生物池的水力停留時間分別為2 h、5.5 h、8.9 h(金鵬康等，2014).其中，第五污水處理廠好氧池內嵌填料氧化溝，以提高氧化能力，系統正常運行過程中污泥濃度約為(4200±300), 污泥齡為20 d，污泥回流比為100%±5%，混合液回流比200%±10%.

　　3個污水廠的生物池進水、生物池出水每隔3~5 d取樣1次，每次取樣100 mL.水樣經0.45 μm膜過濾后測定常規指標;從濾膜上取少量(約1 g)活性污泥于10 mL離心管中，加入7 mL 10%的HCl溶液，振蕩反應，除去樣品中的碳酸鹽，將該混合液15000 r·min-1離心1 min，棄去上清液;再加入7 mL超純水、振蕩、洗脫殘余的HCl，將混合液冷凍干燥，15000 r·min-1離心1 min，棄去上清液;洗脫過程重復兩遍，離心所得污泥樣品經冷凍、干燥、研磨后，測定δ15N值.

　　2.2 測試方法

　　水樣常規指標化學需氧量(COD)、總氮(TN)、氨氮(NH4-N)、硝酸鹽氮(NO3-N)、亞硝酸鹽氮(NO2-N)測定方法分別采用重鉻酸鉀法、過硫酸鉀-紫外分光光度法、納氏比色法、紫外分光光度法和N-(1-萘基)-乙二胺光度法，具體操作步驟見國家標準(國家環境保護總局，2002).pH采用上海大普PHS-3C型精密酸度計測定.

　　活性污泥TN的測定需要在水常規指標測定方法的基礎上進行性預處理，方法如下：稱取1.000 g(精確到0.001)左右樣品，將要測定的樣品稀釋到100 mL，在超聲波里面震動30 min，再對樣品進行離心處理(或用水沖洗過的中速濾紙過濾，棄去初濾液20 mL).取上清液5~15 mL按與校準曲線相同的步驟測量吸光度.

　　冷凍干燥后的活性污泥樣品使用EAS vario PYRO元素分析儀-Isoprime 100同位素比值質譜儀聯機測定δ15N.樣品的δ15N同位素比值用樣品(Rsmp)和標準物質(Rstd)的同位素比值(R)(15N/14N)表示(Yamada et al., 2009), 即：

(1)

　　儀器采用的N參考標準為δ15Nair, 國際原子能機構認定的咖啡因為標準品，磺胺為實驗室標準物質，該方法測定15N的標準偏差為±0.3‰.

　　活性污泥樣品采用低溫保存，然后送樣至基因測序公司委托測序.測序沿用高通量基本測序流程，經DNA提取、PCR擴增、Miseq高通量測序等步驟.DNA提取采用土壤DNA提取方法，高通量測序通過IlluminaMise體系完成.所得結果進行過濾處理，得到優化序列，對優化序列在97%相似度水平進行OTU聚類分析和物種分類學分析，分析樣品的多樣性以及群落結構(冷璐等，2015).

　　3 結果與討論(Results and discussion)3.1 活性污泥δ15N與無機氮含量關系模型的建立

　　為建立活性污泥δ15N與水中無機氮去除效率的關系模型.首先，用瑞利分餾方程(Mariotti et al., 1981)來表示水中無機氮同位素組成與脫氮過程的千分富集因子的關系：

(2)

　　式中，f表示某時刻，未反應的無機氮占反應前總無機氮的比例;ε表示千分富集因子，與同位素分餾系數α的關系為α=1+ε/1000;RA表示某時刻，未反應無機氮的15N/14N值;RA0表示f=1時，無機氮的15N/14N值.

　　如圖 1所示，氨化過程中，同位素富集不明顯(Koba et al., 1998);在亞硝化作用、硝化作用和反硝化作用中，微生物優先利用質量較輕的14N(Onodera et al., 2015)，硝化過程的千分富集因子高達29.4‰ ± 2.4‰，而含有較重同位素的分子被富集在液相的含氮化合物中;在活性污泥同化無機氮的過程中，活性污泥優先利用質量較輕的14N.盡管如此，當活性污泥的生長速率一定時，雖然活性污泥的同化作用存在著同位素分餾現象，但是活性污泥與污水中無機氮的氮同位素組成比例即分餾系數α為常數(Valero et al., 2007).故活性污泥的RM0和無機氮的RA0之比等于硝化過程中任意時刻活性污泥的RM和無機氮的RA之比，其中RM0與RA0對應，表示f=1時，活性污泥和水中無機氮的15N/14N值，RM與RA表示脫氮過程任意時刻活性污泥和無機氮的15N/14N值，即：

　　圖 1

　　圖 1氮的遷移轉化路線及其對δ15N值的影響

(3)

　　根據式(1)(2)(3)，剩余無機氮的占比與脫氮過程中活性污泥的δ15N的關系可表示為：

(4)

　　因為，當x≪1時，ln(x+1)≈x，故式(4)可化為：

(5)

　　此時，水中剩余無機氮的占比就可以表示為固相中活性污泥的δ15NM0的函數，其中，ε和δ15NM0為常數;剩余無機氮占脫氮反應發生前無機氮的比例f由[NH4-N+NOx-N]出水/[NH4-N+NOx-N]進水定義.

　　活性污泥脫氮效率P即為：

(6)

　　該模型即為活性污泥脫氮效率模型.

　　本研究認為活性污泥的增長速率維持恒定.參數ε和δ15NM0由公式(6)確定.利用觀測到的P與δ15NM，在Microsoft-Excel規劃求解下利用非線性方法得出參數ε和δ15NM0的值，目標函數為計算得出的P與相應的實際觀測值的方差，當方差達到最小值時，即得到參數ε和δ15NM0的取值.

　　當進水無機氮含量已知時，可推導出無機氮的去除量方程.進水無機氮負荷用c0×Q表示，c0表示進水無機氮濃度(mg·L-1), Q表示系統進水量(m3·d-1)，無機氮去除量W(t·d-1)可以表示為W=[(1-f)]c0×Q×10-6，即:

(7)

　　該模型即為活性污泥脫氮量模型.

　　3.2 參數計算

　　為獲得式(6)的模型參數，本研究對西安市第五污水處理廠二級生物處理進出水進行了長期監測.二級處理過程進出水的無機氮(NH4-N、NO3-N和NO2-N)濃度(圖 2).其中，TN的進出水濃度分別為(69.18±7.97) mg·L-1和(15.25±6.31) mg·L-1，NH4-N的進出水濃度分別為(40.68±4.96) mg·L-1和(12.63±8.15) mg·L-1，NO3-N和NO2-N的出水濃度分別為(1.07±0.98) mg·L-1和(0.08±0.1) mg·L-1，NO3-N和NO2-N的進水濃度極低，在圖中未作表示.檢測到的NO3-N和NO2-N濃度遠低于NH4-N的去除量，這表明污水中的反硝化反應速率很快，屬硝化作用限制因素.

　　圖 2

　　圖 2生物池進出水水質

　　污泥的δ15N值與無機氮去除率的關系見圖 3.其中，無機氮的去除效率為67.58%±22.83%，污泥的δ15N值為8.06±2.00.從圖 3中可以看出污泥δ15N值與無機氮去除率具有極強的相關性(r=0.893，p<0.001).故利用本文3.1節建立的模型(式(6))，將圖 3數據在Microsoft-Excel規劃求解下利用非線性方法得出參數ε和δ15NM0的值，目標函數為計算得出的f與相應的實際觀測值的方差，當方差達到最小值時，取得到參數ε和δ15NM0的值，計算結果為ε=-3.53‰，δ15NM0=3.55‰.已經有實驗表明，在海洋環境下，浮游生物的δ15N值與NO3-N濃度之間的ε值介于-2.5‰到-5‰之間(Wada et al., 1980)，NO3-N中的δ15N值與NO2-N濃度之間的ε值介于-3‰到-9‰之間(Sigman et al., 2001).本文得到的ε值也處于上述范圍之內，計算結果合理.

　　圖 3

　　圖 3無機氮去除率與δ15N關系

　　3.3 參數驗證

　　因為西安市第五污水廠生物池出水無機氮中95%為氨氮(硝化限制作用)，為驗證3.2節所得參數在不同無機氮組成情況下的適用性，本文挑選了出水無機氮中高硝態氮含量(反硝化限制作用)和硝態氮與氨氮含量相當(氨化限制作用)的西安市第三、第四污水處理廠進行參數驗證.

　　西安市第三、第四污水處理廠生物池進出水水質特性如表 1所示.將測得的二沉池進水中活性污泥的δ15N、ε及δ15NM0帶入式(6)進行無機氮去除效率的預測并與實際測得的無機氮去除率進行相關性分析，結果如圖 4所示.其中，圖 4a為西安市第三污水處理廠的預測結果與實際值的對比(r=0.857，p<0.001)，圖 4b為西安市的四污水處理廠的預測結果與實際值的對比(r=0.886，p<0.001).該結果表明，上文所得模型對具有不同水處理限制因素的污水處理廠均適用.

　　圖 4

　　3.4 模型應用

　　為進一步研究活性污泥脫氮效率模型在不同工況下的適用性，本研究設置了3種(1#、2#、3#)不同工況的反應器.調節運行參數，使3個反應器具有不同的脫氮效率.本文對這三個反應器進行了長期觀測，測得3個反應器的實際去除效率分別為94.54%、74.47%和23%;活性污泥同位素水平為13.97‰、8.33‰和4.47‰.測定每個循環的進出水無機氮濃度、反應器中活性污泥的δ15N值、進水量Q以及模型參數，分別帶入評價模型(式(7))，對無機氮的實際去除量與預測去除量進行相關性分析，如圖 5所示.結果表明，1#(r=0.894，p<0.001)、2#(r=0.821，p<0.01)、3#(r=0.884，p<0.01)反應器均表現出顯著相關，這說明該模型的使用不受工況限制，對于不同工況下的水處理系統，均可以用式(7)從微生物角度評價活性污泥的脫氮性能.

　　圖 5

　　圖 5不同工況下無機氮去除量預測值與實際值的對比

　　為進一步研究活性污泥δ15N值與脫氮細菌多樣性及群落組成之間的關系，本文對脫氮效率分別為94.54%、74.47%和23%，活性污泥同位素水平為13.97‰、8.33‰和4.47‰的1#、2#和3#3個反應器中的細菌多樣性及豐富度進行分析.

　　由表 2可以看出，3個反應器的序列條數和OUT數差異較大，分別在30875~25188和20244~22341之間.Chao、Shannon、ACE指數表明各反應器中的物種豐富度，其中，Shannon指數反映了基于物種數量的群落種類多樣性，其變化趨勢與Chao和ACE指數的變化趨勢一致.總體來看，活性污泥的多樣性指數與活性污泥脫氮效率和δ15N值成反比，由此可見，活性污泥的脫氮能力和δ15N值對其多樣性指數有明顯影響，這部分影響可能與活性污泥中與脫氮作用相關的微生物有關.具體聯系污水寶或參見http://m.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　為驗證上述結論，對3個反應器內活性污泥的16S rDNA在門分類層面上進行對比，結果如圖 6所示.3種活性污泥樣品共檢測出12個菌門，其中，與脫氮過程相關的菌門包括Proteobacteria(圖中C色塊), Planctomycetes(圖中B色塊)和Nitrospirae(圖中A色塊)3個菌門.大多數反硝化細菌、氨氧化細菌、亞硝酸鹽氧化細菌屬于Proteobacteria門(王春香等，2014)，厭氧氨氧化細菌屬于Planctomycetes門(曹雁等，2017)，部分亞硝酸鹽氧化細菌屬于Nitrospirae門(林婷，2012).隨著活性污泥δ15N值的下降，3個菌門的相對百分比均呈下降趨勢.1#反應器的無機氮去除率為94.54%，δ15N為13.97‰，Proteobacteria門、Planctomycetes門和Nitrospirae門的相對百分比在3個反應器中最高，分別為31.12%、18.21%和0.57%，但其種群豐富度卻低于另外兩個反應器，這說明與脫氮相關的功能性菌群的富集使得其他競爭力較弱的菌群數量減少，群落豐富度低，但無機氮去除效率高.2#反應器中3個與脫氮相關的菌門所占的相對百分比分別為25.42%、15.17%和0.44%，略低于1#反應器，但種群豐富度卻大于1#反應器.這解釋了2#反應器無機氮去除效率(74.47%)和δ15N(8.33‰)低于1#反應器的內因，即與脫氮相關的功能性菌群比例下降，原本競爭力較弱的菌群種類增多，與功能性菌群爭奪營養物質，導致2#反應器中污泥脫氮活性較1#反應器低.3#反應器中Proteobacteria門占12.83%、Planctomycetes門8.44%、Nitrospirae門0.15%，在3個反應器中占比最低，因此其無機氮去除效率(23%)和δ15N(4.47‰)水平也最低，活性污泥脫氮活性的降低也導致了其他種類微生物增多，種群豐富度大幅上升.

　　圖 6

　　圖 6不同工況群落組成相對百分比

　　綜上，活性污泥δ15N值越大，其脫氮性能越強，與脫氮作用相關的細菌占據主導地位，其種群豐富度越低;活性污泥δ15N值越小，其脫氮性能越差，與脫氮作用相關的細菌喪失了其主導作用，種群豐富度增高.

　　4 結論(Conclusions)

　　1) 建立了污泥脫氮性能評價模型，模型描述了在活性污泥持續生長的硝化反硝化系統中，活性污泥δ15N值與無機氮去除效率之間的相關關系.

　　2) 該模型參數適用于具有不同無機氮組成和不同工況的活性污泥處理系統.實現了通過監測活性污泥δ15N值，就能夠準確反饋出生物系統的脫氮能力，為污水廠脫氮問題分析提供了新的方法和思路.

　　3)δ15N值的檢測不僅可以用于模型計算得出活性污泥無機氮去除效率，還可以表征活性污泥中微生物的脫氮活性.(來源：環境科學學報 作者：孟妮娜)