飲用水安全直接關系到城鄉(xiāng)居民的身體健康及社會經濟穩(wěn)定發(fā)展，所以國家高度重視飲用水安全問題，相繼發(fā)布了《全國城市飲用水安全保障規(guī)劃(2006-2020年)》、《城市供水水質管理規(guī)定》、《水污染防治行動計劃》等一系列文件，修訂了《生活飲用水衛(wèi)生標準》并于2012年7月1日起在我國全面實施，飲用水安全保障力度不斷加大.針對目前我國原水微污染的水質狀況，供水企業(yè)一方面通過改造和強化傳統(tǒng)工藝，并增加預處理或深度處理工藝，使出廠水質達到新的標準，另一方面則通過強化消毒工藝和控制管網余氯量來保證管網水的微生物學指標達標.

　　經過工藝處理進入管網的飲用水中的微生物并不能完全被滅活，一旦條件變化(余氯衰減，殘存的營養(yǎng)物質濃度變化等)，有一部分就會在管網中繁殖和恢復活性，這其中還存在著活的但不可培養(yǎng)的微生物(viable but non-culturable, VBNC)，這些微生物無法通過細菌培養(yǎng)的方法[6]檢出. VBNC中如果存在致病菌，在適宜環(huán)境條件下復活并大量繁殖，則直接威脅到飲用水水質安全.因此，快速、準確地進行管網水微生物的定量定性，是供水企業(yè)能夠迅速采取措施控制微生物生長繁殖，保證供水水質衛(wèi)生安全的前提.近年來，國內外研究者不斷采用新的細菌檢測方法對細菌進行快速計數(shù)，取得了很好的效果.

　　為克服傳統(tǒng)培養(yǎng)方法計數(shù)結果偏低、培養(yǎng)時間長以及部分微生物無法檢出的局限性，本研究采用快速準確且操作相對簡便的熒光顯微鏡直接鏡檢法，對配水管網水中的細菌進行計數(shù)和觀察.本研究以活菌數(shù)占細菌總數(shù)的比值來表征試驗管網水的整體細菌活性，并對飲用水中常見形態(tài)細菌以及整體細菌活性受余氯、溫度、濁度、流速等因素影響的變化進行了分析，結果對快速預估配水管網中生物安全性風險具有一定意義，同時也有利于供水企業(yè)根據(jù)預估結果調整工藝參數(shù)、保障供水安全.

　　1 材料與方法1.1 試驗管網與試驗采樣

　　雖然試驗管網與實際配水管網的環(huán)境條件存在一些差異，但是采用試驗管網能夠根據(jù)試驗需要來調節(jié)影響細菌生長的參數(shù)變化，更好地了解細菌數(shù)量和整體活性受多個因素影響的變化規(guī)律.為了模擬實際配水管網水中細菌的生長變化情況，按圖 1所示，采用PE管、閘閥、流量計、循環(huán)水箱及離心泵等管件與設備，在實驗室搭建了模擬配水管網.試驗用水直接引自北方某市配水管網.裝置啟動后，首先投加次氯酸鈉溶液使水中自由余氯的初始值接近實際水廠清水池出水的余氯值;其次通過試驗用水的封閉循環(huán)來模擬飲用水在實際配水管網中的流動;最后在取樣點采樣進行試驗.取樣點選在模擬管網主干管上的中點，以間隔一定時間的采樣分析結果，來模擬實際配水管網的沿程水質.本研究于2014年8月至2015年7月對選定取樣點進行取樣，水樣按照標準方法采集后盡快送回實驗室進行分析，并按照國家標準方法對研究需要的指標進行測定.

1.離心泵;2.止回閥;3.閘閥;4.取樣龍頭;5.密封與平衡裝置;6.加藥管;7.進水管;8.排水管;9.循環(huán)水箱;10.管網示意

圖 1 模擬配水管網示意

　　1.2 儀器與藥品

　　總余氯與自由余氯：使用HACH46 700-001型總氯-余氯儀;HACH-DPD自由余氯測定藥劑，HACH-DPD總余氯測定藥劑.濁度：HACH2100AN型濁度儀.細菌總數(shù)和活菌數(shù)：使用Olympus-BX51型熒光顯微鏡，采用吖啶橙(acridine orange)染色鏡檢.

　　吖啶橙是技術相對成熟的熒光鏡檢染色劑.它能夠透過細胞膜，與細胞核內的DNA和細胞質內的RNA結合，并在波長為436~490 nm的激發(fā)光的激發(fā)下發(fā)出熒光.它與DNA結合可發(fā)射出黃綠色或綠色熒光，與RNA結合可發(fā)出橙色至鮮紅色熒光.即使DNA在沒有活性的細胞內，吖啶橙也能與其結合將其染色，因此可以用來計數(shù)細菌總數(shù).

　　1.3 試驗方法

　　細菌總數(shù)計數(shù)采用吖啶橙染色直接計數(shù)法[15](acridine orange direct counts，AODC).水樣用無菌磨口玻璃瓶采集后迅速加入甲醛固定，甲醛最終含量2%.將0.5 mL含量為0.2%的吖啶橙(BBI公司)溶液加入10 mL固定后水樣中，染色1~2 min.染色后的水樣使用溶劑負壓過濾器以微孔濾膜(孔徑0.2 μm，直徑47 mm，黑色聚碳酸酯膜，Millipore公司)過濾.將過濾后的濾膜置于載玻片上并固定，用落射熒光顯微鏡觀察，計數(shù)發(fā)綠色或橙色熒光的菌體.顯微鏡光源為汞燈，激發(fā)光濾光片450~490 nm，光束分離濾光片510 nm，阻擋濾光片520 nm.隨機選取10個視野的計數(shù)結果取平均值，根據(jù)視野面積和過濾面積的比值計算出單位體積水樣中的細菌數(shù)量.

　　活菌數(shù)計數(shù)采用活菌直接計數(shù)法[16](direct viable counts，DVC-N.A).向10 mL水樣中加入最終含量為0.002%的萘啶酮酸(nalidixic acid, N.A, BBI公司)和最終含量為0.025%的酵母膏(上海生工生物工程公司)，25℃避光培養(yǎng)6 h后用甲醛固定.再將固定后的水樣按照AODC法直接鏡檢計數(shù)，視野中長大或變粗的菌體被認為是活菌.

　　2 結果與分析2.1 細菌計數(shù)結果比較

　　加氯后在試驗管網取水點取樣，隨著余氯不斷衰減取多組水樣，并從中選取4組水樣，分別使用R2A培養(yǎng)基平板計數(shù)和吖啶橙染色直接計數(shù)兩種不同方法對水樣中的細菌進行計數(shù).每組水樣均取等量的6份，即每種計數(shù)方法對每組水樣平行測定3次，取計數(shù)結果的平均值.兩種方法對4組水樣中細菌的計數(shù)結果見表 1.使用R2A作為培養(yǎng)基的平板計數(shù)法得到水樣中的活菌數(shù)在100~102 cfu·mL-1，而吖啶橙染色熒光顯微鏡直接鏡檢計數(shù)法得到水樣中的活菌數(shù)在103~104 cells·mL-1，比使用R2A作為培養(yǎng)基的平板計數(shù)法高出1~3個量級，明顯高于培養(yǎng)法.直接鏡檢計數(shù)法不僅能夠計數(shù)活細菌，還能夠計數(shù)受損和死亡細菌數(shù)量，得到水樣中的細菌總數(shù)在104~105cells·mL-1.類似的試驗在冬季也進行了運行，并與夏季運行的結果對比.冬季的HPC-R2A法計數(shù)結果在100~102 cfu·mL-1，檢出量級更低，甚至有個別水樣未檢出.而鏡檢計數(shù)結果檢出的量級仍在103~104cells·mL-1.且鏡檢法能夠直觀地觀察到細菌的形態(tài)，有助于更好地掌握細菌的變化規(guī)律(見圖 2).

　　表 1 R2A培養(yǎng)法和AO染色鏡檢法細菌計數(shù)結果比較

圖 2 不同形態(tài)細菌

　　2.2 不同理化指標下細菌數(shù)量和總體活性的變化2.2.1 不同余氯量下細菌數(shù)量和總體活性的變化

　　采用活菌數(shù)與細菌總數(shù)的比值來表征管網中細菌的整體活性.細菌數(shù)量和總體活性與余氯衰減的關系見圖 3.向循環(huán)水箱中投加次氯酸鈉溶液后，馬上開始取樣測定.測定活菌數(shù)為22 680 cells·mL-1(各形態(tài)活菌占活菌總數(shù)的比例見表 2)，活菌數(shù)占細菌總數(shù)的比例為15.12%.當余氯濃度達到最大值時，活菌的數(shù)量開始減少.此時水樣中活菌數(shù)為21 088 cells·mL-1，活弧形菌所占比例顯著降低(見表 2)，在活菌比例最低時(達9.21%)，活菌中短桿形菌所占的比例較余氯濃度最大時提高了5.8%，而此時球形菌和長桿形菌所占比例變化不大，弧形菌所占比例降至為0(見表 2).隨著余氯的衰減，活菌所占比例不斷增大，而且活菌中桿形菌的數(shù)量增速更快(圖 4)，平均數(shù)量增速(從活菌比例最低至循環(huán)結束時間段內)為46 cells·(mL·min)-1，而球形菌和弧形菌僅為30 cells·(mL·min)-1和7 cells·(mL·min)-1.當水中余氯濃度低于0.3 mg·L-1時，活菌在細菌總數(shù)中所占比例開始增大，最高可達到20.25%，遠高于余氯濃度為0.52 mg·L-1時9.34%的活菌比例.

　　表 2 水循環(huán)中不同時刻各形態(tài)細菌所占比例

圖 3 整體細菌活性受余氯影響的變化

圖 4 低殘留余氯濃度水樣中的活菌

　　2.2.2 不同溫度下細菌數(shù)量和總體活性的變化

　　模擬管網用水來自以地表水為水源的市政管網，所以四季水溫相差較大，冬季的試驗水溫一般低于11℃，而夏季的試驗水溫一般高于19℃.分別選取每月平行試驗中余氯約為0.55、0.30和0.00 mg·L-1的水樣，分析不同季節(jié)細菌數(shù)量和總體活性受水溫影響的變化規(guī)律(圖 5).在余氯低于0.3 mg·L-1時，活菌數(shù)占細菌總數(shù)的比值因為溫度的不同而相差較大，可達2.48%.對比不同季節(jié)66份管網水樣的鏡檢結果，未投加次氯酸鈉時，夏季水樣中桿形菌占細菌總數(shù)的62.8%~68.3%，高于冬季的52.9%~66.7%，而在活菌比例最低時夏季試驗水樣中桿形菌占細菌總數(shù)的45.1%~54.7%，低于冬季管網中的58.7%~62.6%，說明在水溫較高時，桿形菌對次氯酸鈉的耐受性變差.另外，在夏季水樣中存在許多活的短桿形菌(見圖 6)，是冬季水樣中少見的.

圖 5 整體細菌活性受不同月份水溫的影響

圖 6 夏季水樣中經過培養(yǎng)的活短桿形菌

　　2.2.3 不同濁度下細菌數(shù)量和總體活性的變化

　　為了研究濁度與細菌數(shù)量之間的關系，取不同季節(jié)不同循環(huán)未投加消毒劑之前的試驗循環(huán)水，樣品編號按濁度由小到大排列，分別測定了濁度和活菌數(shù)，結果見圖 7.濁度與活菌數(shù)之間的相關系數(shù)高達0.979 8.

圖 7 活菌數(shù)與濁度的相關性

　　余氯約為0.3 mg·L-1時不同濁度下的計數(shù)結果(圖 8)，濁度最大值2.28 NTU，最小值1.64 NTU，相差0.64 NTU;活菌數(shù)占細菌總數(shù)的比值相應地相差2.95%.濁度超過2 NTU時，活菌數(shù)比例增大明顯.由于試驗采用的是自建的管網，每次運行前雖然對管網進行沖洗，但難免會有少量的搭建管網時殘留的管材碎屑.另外，運行前的沖洗突然改變了管網的水力條件，沖刷下了管壁附著的細菌及沉淀物質，也增加了試驗用水的濁度.并且，試驗用水引自的管網是年代較遠的傳統(tǒng)管材管網，其中的水自身濁度較高.上述原因造成了試驗水濁度基本高于0.5 NTU.

圖 8 整體細菌活性受濁度的影響

　　2.2.4 不同流速下細菌數(shù)量和總體活性的變化

　　為了縮短研究時間，盡快取得管壁生物膜，所以試驗管網在設計和運行時均考慮到流速的問題，使實際運行的流速低于經濟流速.試驗配水管網中水的流速通過每個管段上的閥門控制在0.4~1.7 m·s-1.被沖刷下來的生物膜會懸浮在水樣中，在染色過濾時被截留在微孔濾膜上.由圖 9可見被沖刷下的生物膜內存在活菌.

圖 9 被沖刷下來的管壁生物膜

　　在封閉循環(huán)試驗結束后，保持主干管流量為1 m3·h-1運行(采用非循環(huán)方式)18 h，分別在試驗管網始端管段的上游和下游龍頭取水樣(樣品1和2)，之后迅速旋該管段上下游閥門至開啟度最大，并同時在這兩個龍頭再取水樣(樣品3和4)，分別測定4個水樣中活菌數(shù)和細菌總數(shù)，測定結果見圖 10.可見流速的突然增大從管壁上沖刷下生物膜，引起了水中細菌數(shù)量的增多，尤其是活菌數(shù)量的增幅更大，導致水中整體細菌活性增強.因此，盡量避免引起流速突變(如水錘等現(xiàn)象)，防止管網中流速突然增大，也是控制飲用水中細菌數(shù)量激增的有效措施.

圖 10 整體細菌活性受流速的影響

　　3 討論3.1 細菌計數(shù)方法的比較

　　瓊脂平板計數(shù)法(agar plate counts)是至目前國內應用最廣泛且使用時間最長的飲用水中異養(yǎng)菌的計數(shù)方法.近年來也有很多研究者使用R2A培養(yǎng)基進行平板培養(yǎng)計數(shù)來克服受損菌體不能在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上正常生長的局限性，使計數(shù)結果更高.但是培養(yǎng)基為細菌提供的生長環(huán)境還是與飲用水系統(tǒng)的貧營養(yǎng)環(huán)境差異較大，使用培養(yǎng)方法檢測飲用水系統(tǒng)中的所有細菌還是難以獲得較為準確的結果，有個別樣品還會因為涂布時的操作不當造成污染而得不到計數(shù)結果.并且使用HPC-R2A法培養(yǎng)，細菌生長緩慢，數(shù)量一般從培養(yǎng)的第4 d、第5 d開始才增多較快，那么要想得到準確的計數(shù)結果，采用常規(guī)的7 d培養(yǎng)法是不夠的，不能使供水企業(yè)迅速地得到細菌數(shù)量超標的信息并及時采取控制措施.雖然掃描電鏡使視野清晰，但是對于觀察前細菌的分離技術要求較高，且前處理時間也稍長，所以還多用于對觀察細菌形態(tài).利用流式細胞術、ATP方法、分子探針、基因芯片等測定飲用水中的微生物也能快速獲得相對準確的計數(shù)結果，但是對操作人員的要求較高，也不能作為供水企業(yè)的首選.而熒光顯微鏡鏡檢法可以直接對水樣中的細菌進行計數(shù)，對細菌的生長環(huán)境改變不大.而且熒光顯微鏡觀察計數(shù)十分快捷，從取樣至檢出只需30 min左右.顯微鏡直接鏡檢計數(shù)法快捷、穩(wěn)定、經濟性好，是在實際應用中對飲用水管網中細菌進行快速計數(shù)的可行方法.

　　3.2 細菌數(shù)量和整體活性受理化指標影響的變化規(guī)律3.2.1 細菌數(shù)量和整體活性受余氯影響的變化規(guī)律

　　由前述試驗結果可知，在投氯的初始時刻，消毒劑中的有效成分還未完全對微生物產生作用，活菌的比例還很高.余氯濃度最大時，弧形菌比例較初始時刻大幅降低，而其它形態(tài)細菌比例變化沒有過于明顯，說明配水管網水中的大部分種屬的弧形菌對次氯酸鈉消毒劑的耐受力較桿形菌和球形菌弱.活菌比例最低時，短桿形菌比例升高而弧形菌比例幾乎降至為零，長桿形菌和球形菌比例變化不大，說明配水管網水中的短桿形菌對次氯酸鈉消毒劑的耐受能力最強.另外，余氯對于細菌的滅活相對于余氯衰減存在時間上的滯后性，即余氯濃度最大時，活菌比例并未達降至最低，尤其是對于菌膠團中細菌的滅活.隨著余氯衰減，桿形菌比例增長明顯，說明桿形菌的繁殖和活性恢復能力較強.活弧形菌的再次出現(xiàn)說明消毒劑并不能完全殺滅水中的細菌，而是殺滅一部分細菌，對另一部分細菌僅能發(fā)揮抑制活性作用.所以這時雖然水中仍存有一定濃度的余氯，但是已不能有效地控制細菌的繁殖和活性恢復.

　　3.2.2 細菌數(shù)量和整體活性受溫度影響的變化規(guī)律

　　水溫高時整體細菌活性較強，因為水溫高有利于細菌的繁殖.而且水溫高時余氯的衰減加快，也相應減小了余氯的滅活作用.水溫高時桿形菌比例相對低，說明桿形菌對溫度較高時的消毒劑較敏感，即桿形菌對熱力消毒敏感.根據(jù)地下水和地表水的水溫特點，由以上分析可知，夏季的地表水更有利于細菌的生長繁殖和活性恢復，所以采用地表水水源的水廠在夏季更應關注微生物學指標.

　　3.2.3 細菌數(shù)量和整體活性受濁度影響的變化規(guī)律

　　水中的微生物會附著在懸浮顆粒上呈離散的非溶解狀態(tài)，這些懸浮顆粒給微生物的生長繁殖提供了保護.所以美國在2002年把濁度列入了微生物學指標，指標限值也更為嚴格.由試驗結果可知配水管網水中的濁度大則細菌數(shù)量多，整體細菌活性也強，說明活菌受到了懸浮顆粒包裹物的保護.實測的濁度與活菌數(shù)之間的相關系數(shù)高達0.979 8，即微生物繁殖和復活在一定程度上也取決于濁度的高低.因此，控制出廠水及配水管網中的濁度水平，對于控制活菌數(shù)也是有效措施.

　　3.2.4 細菌數(shù)量和整體活性受流速影響的變化規(guī)律

　　當流速大時由于水力剪切作用，附著在管壁上的生物膜會被水流沖刷下來，并隨著水流流向管網下游，造成細菌數(shù)量的激增.并且這些生物膜給細菌的生長繁殖和避開滅活提供了保護.流速的增大使得從管壁上沖刷下更多的生物膜，引起了水中細菌數(shù)量的增多，尤其是活菌數(shù)量的增幅更大，導致水中整體細菌活性增強.因此，盡量避免管網中流速突然增大，也是控制飲用水中細菌數(shù)量激增的有效措施.

　　3.3 吖啶橙染色熒光顯微鏡直接鏡檢法需要注意的問題

　　吖啶橙不但可以將水中的微生物染色，還可將部分雜質染色，因此鏡檢觀察時應只計數(shù)細胞形態(tài)的熒光物.水樣要充分過濾，否則殘留在膜上的水痕會干擾觀察.觀察計數(shù)每個視野前應使部分干擾物的熒光淬滅.具體參見污水寶商城資料或http://m.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　4 結論

　　(1) 吖啶橙染色熒光顯微鏡直接鏡檢應用于計數(shù)模擬配水管網中的微生物數(shù)量能夠得到較穩(wěn)定的結果.計數(shù)得到水樣中的活菌數(shù)在103~104cells·mL-1，比使用R2A作為培養(yǎng)基的平板計數(shù)法高出1~3個量級;水樣中的細菌總數(shù)在104~105cells·mL-1.每個水樣的鏡檢時間僅需30 min左右.所以吖啶橙染色熒光顯微鏡直接鏡檢是對配水管網中細菌進行計數(shù)的較優(yōu)方法.

　　(2) 模擬配水管網水中整體細菌活性與水溫、濁度和流速都存在正相關關系;與運行穩(wěn)定后的余氯存在負相關關系.可根據(jù)細菌活性確定不同季節(jié)和原水水質下的更準確的投氯量.

　　(3) 模擬配水管網水中常見形態(tài)的細菌對次氯酸鈉消毒劑的耐受能力依次為：短桿形菌>球形菌>長桿形菌>弧形菌，并且桿形菌恢復活性和再繁殖的能力較強.夏季水樣中短桿形菌多于冬季.