1 引言

　　污水厭氧生化處理過程是指在無分子氧參與的條件下，有機物通過厭氧污泥中多種微生物的生化作用，分解為有機酸、CH4、CO2、H2等產(chǎn)物的過程.由于其具有處理負荷高、剩余污泥少、可產(chǎn)生沼氣等特征，因而在有機固體廢物(剩余污泥、廚余、農(nóng)業(yè)廢棄物)減量、高濃度有機廢水、難降解廢水等處理中廣泛應用.影響厭氧處理過程的因子包括基礎因素(厭氧污泥組成、濃度、污泥負荷等)和環(huán)境因素(pH、ORP、抑制性物質(zhì)等)兩大類，其中，厭氧污泥的生物相組成和代謝活性對厭氧生化處理的過程進展發(fā)揮著重要的作用.當采用不同的接種厭氧污泥時，由于微生物構(gòu)成、對基質(zhì)的適應性和接種量的不同，厭氧污泥產(chǎn)CH4活性存在較大差異.對厭氧污泥的產(chǎn)CH4活性進行系統(tǒng)地對比與研究，確定厭氧污泥產(chǎn)CH4生成勢，一方面可對厭氧污泥的厭氧凈化性能和產(chǎn)CH4活性進行評價，同時也能為厭氧工藝的關鍵操作參數(shù)優(yōu)化提供依據(jù).

　　末端限制性片段多態(tài)性(Terminal-Restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)分析方法由RFLP發(fā)展而來，又稱為16S rRNA基因的末端限制性片段分析技術(shù)，是目前微生物分子生物學研究中有效的研究手段之一.該方法將PCR引物中的一條加以熒光標記，對擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進行切割并電泳，根據(jù)片斷的大小不同及標記片斷種類和數(shù)量的不同來分析群落的結(jié)構(gòu)及組成.Marsh等(1998)采用T-RFLP分析了活性污泥、生物反應器、沙質(zhì)、地下水及白蟻消化道中的細菌組成，比較了這些群落結(jié)構(gòu)的相似性，并將6種已知菌混和在一起組成模擬的群落進行了分析.Lüdemann等(2000)采用該技術(shù)分析了水稻種植區(qū)土壤中沿著氧垂直梯度上的細菌群落組成變化，同時結(jié)合16S rDNA克隆文庫的構(gòu)建和測序分析，獲得了與氧垂直梯度相關的不同深度細菌群落組成情況.當前該技術(shù)已成功應用于微生物群落組成和結(jié)構(gòu)及微生物系統(tǒng)發(fā)育等研究，在產(chǎn)CH4菌和CH4氧化菌的群落結(jié)構(gòu)、動態(tài)變化的檢測中發(fā)揮著重要的作用.

　　本研究采用厭氧污泥生化產(chǎn)CH4生成勢(Biological methane potential，BMP)的測試方法，對AP、DH兩污水處理廠的厭氧污泥進行批次實驗，并對兩廠厭氧污泥的產(chǎn)氣速率與基質(zhì)濃度進行回歸，得出產(chǎn)CH4的關鍵參數(shù)，評價不同厭氧污泥的產(chǎn)CH4生成勢.同時，對批次實驗前后的水質(zhì)變化進行分析，結(jié)合厭氧污泥的T-RFLP與SEM分析結(jié)果，對兩種厭氧污泥產(chǎn)CH4生成勢的差異進行解析.

　　2 材料與方法

　　2.1 厭氧污泥來源與特征

　　本研究所用的兩種厭氧污泥分別來自于AP和DH兩污水處理廠的污泥厭氧消化池，AP污水處理廠采用合流制明渠排水溝進水，進水水質(zhì)易受降雨影響，且泥沙等無機顆粒含量較高;DH污水處理廠配套管網(wǎng)設施完善，進水為完整的下水管網(wǎng)收集的城市生活污水.污水廠長期的監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，AP厭氧污泥的VSS/TSS值多在0.5以下，而DH厭氧污泥的VSS/TSS值維持在0.6以上.

　　2.2 BMP實驗設計

　　AP-BMP、DH-BMP共設置5組不同的食微比S/X(0、0.1、0.2、0.4、0.6)進行BMP實驗，實測S/X如表 1所示.依據(jù)測試基質(zhì)濃度在120 mL的血清瓶中加入定量儲備NaAc溶液，基質(zhì)體積為60 mL.厭氧微量元素溶液采用提出的配方，其中，CaCl2 · 2H2O、NH4Cl、MgCl2 · 6H2O、KCl、MnCl2 · 4H2O、CoCl2 · 6H2O、H3BO3、CuCl2 · 2H2O、Na2MoO4 · 2H2O、ZnCl2的濃度分別為16.7、26.6、120、86.7、1.33、2、0.38、0.18、0.17、0.14 g · L-1.每個血清瓶加入27 mL的微量元素液體和5.4 mL的(NH4)2HPO4(26.7 g · L-1)，之后接種同量的厭氧污泥后，蓋上膠蓋并用鋁箔封口.在35 ℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱內(nèi)進行實驗，實驗過程中以玻璃注射筒(50 mL)測量總產(chǎn)氣量，并利用GC-ECD測定CH4、CO2和H2的比例.AP-BMP、DH-BMP分別設置兩組平行實驗，產(chǎn)氣量測量可精確到0.1 mL.

表 1 BMP實驗實測S/X比

　　2.3 分析方法

　　2.3.1 常規(guī)指標

　　常規(guī)水質(zhì)指標包括pH(Suntex Ion Analyzer 3000A)、SS(Sartorius Analytic Oven)、VSS(Sartorius Analytic Furnace)、NH3-N(Autotitrator AT-400KYOTO)、TKN(Autotitrator AT-400KYOTO)、COD(回流加熱滴定)等，均依照美國EPA規(guī)定的標準方法進行.實驗過程中氣體成分(CH4、CO2和H2)的測量采用氣相色譜(China Chromatography GC8900T)進行.厭氧污泥SEM鏡檢用Hitachi-2500 SEM進行.

　　2.3.2 T-RFLP分析

　　本文參照了Tillmann等(2000)建立的T-RFLP方法對實驗前后厭氧污泥的生物多樣性進行分析，步驟如下：①通過PCR來復制DNA樣品中的目標基因，引物為在5′的尾端上帶有熒光的Ar 109f和Ar 912r*，首先在94 ℃預變性5 min，擴增循環(huán)階段包括94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共循環(huán)28次，最后在72 ℃條件下延伸6 min;②在8.5 μL的PCR產(chǎn)物中加入0.5 μL Taq I和1.5 μL的緩沖溶液，在65 ℃條件下消化切割2 h;③將切割后的片段利用電泳分離并以熒光偵測器(全自動遺傳分析儀，ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer)檢測片段上所帶的熒光強度.Tillmann等(2000)成功分離、克隆出產(chǎn)CH4髦毛菌Methanosaeta spp.、產(chǎn)CH4微菌Methanomicrobiaceae、RC-I和產(chǎn)CH4桿菌Methanobacteriaceae，未能定性的菌種歸入Diverse類.

　　2.3.3 數(shù)據(jù)分析

　　BMP實驗中的累積CH4產(chǎn)氣量采用改進的Gompertz模型回歸分析：

　　式中，y為累積產(chǎn)氣量(mL)，δ為產(chǎn)氣末期校正斜率(mL · h-1)，t為反應時間(h)，A為平衡產(chǎn)氣量(mL)，Rmax為最大產(chǎn)氣速率(mL · h-1)，λ為遲滯期(h).

　　底物的厭氧代謝過程實質(zhì)上是一系列的酶促反應，因此，采用Michaelis-Menten模型描述基質(zhì)濃度與比產(chǎn)氣速率的關系：

　　式中，Vmax為最大比產(chǎn)氣速率(mL · g-1 · d-1，以VSS計)，V為比產(chǎn)氣速率(mL · g-1 · d-1，以VSS計)，Km為半飽和常數(shù)(mg · L-1，以COD計)，S為基質(zhì)濃度(mg · L-1，以COD計).

　　3 結(jié)果與討論

　　3.1 BMP產(chǎn)氣結(jié)果分析

　　AP-BMP、DH-BMP批次實驗持續(xù)時間分別為239 h、286 h，由圖 1可知，5組不同投配比條件下的累積產(chǎn)氣量存在著明顯的差異.實驗初期，累積產(chǎn)氣量差異不明顯，后期逐步增大.氣體成分以CH4(80%)、CO2(20%)為主，同時存在少量的H2(不足1%).以NaAc為基質(zhì)的實驗，由于不經(jīng)歷酸化水解的限速階段，產(chǎn)氣速度較快，但高濃度的NaAc對厭氧污泥也存在著一定的抑制作用，例如，DH-BMP實驗中，S/X值最高的4#樣品產(chǎn)CH4量在170 h后才超過3#樣品.AP-BMP實驗中，4#樣品的產(chǎn)CH4量最高，達到了166 mL，DH-BMP中最高的產(chǎn)CH4量達到了201 mL.

　　圖 1 實測CH4累積產(chǎn)氣量與回歸曲線

　　應用改進的Gompertz模型對AP-BMP、DH-BMP產(chǎn)氣進行回歸后的參數(shù)如表 2所示.兩廠的厭氧污泥產(chǎn)氣數(shù)據(jù)與改進的Gompertz模型擬合較好(R2>0.99).通常厭氧消化過程中的限速步驟為水解破壁過程(Noike et al., 1985)，在無添加外來基質(zhì)的0#樣品中，AP、DH厭氧污泥的遲滯期分別為13.56、0 h，表明DH厭氧污泥的活性較高.投加基質(zhì)NaAc對厭氧污泥具有一定的抑制作用，且抑制作用隨基質(zhì)濃度的提高而提升.DH厭氧污泥4#條件下遲滯期達到48.80 h，可能與4#樣品中S/X最高(0.67)有關.Prashanth等(2006)指出，較高的S/X比造成的氨氮和揮發(fā)酸的積累，對厭氧菌群產(chǎn)生一定的抑制作用，通常較低S/X值下的遲滯期較短(Chen et al., 1996).而在AP-BMP實驗中，無添加基質(zhì)的0#的遲滯期達到了13.56 h，高于添加添加基質(zhì)的1#、2#.這可能是由于AP厭氧污泥的反應活性較差，在無基質(zhì)添加條件下需調(diào)整造成的.

表 2 改進Gompertz模型回歸BMP實驗參數(shù)

　　采用Michaelis-Menten模型對兩個批次實驗的基質(zhì)濃度、比產(chǎn)氣速率進行回歸分析后的結(jié)果如圖 2所示(R2>0.99).由圖可知，AP、DH厭氧污泥的最大比產(chǎn)氣速率差距不大，分別為67.93、62.65 mL · g-1 · d-1(以VSS計)，但兩廠厭氧污泥的Km存 在著顯著的差異，DH厭氧污泥的Km為801 mg · L-1，而AP厭氧污泥的Km高達1517 mg · L-1.Km是表征底物親和力的常數(shù)，表明AP厭氧污泥對基質(zhì)NaAc的適應性差，需要在較高的基質(zhì)濃度下才能表現(xiàn)出較好的產(chǎn)CH4性能.

　　圖 2 Michaelis-Menten模型回歸BMP產(chǎn)CH4速率參數(shù)

　　3.2 水質(zhì)變化分析

　　AP-BMP、DH-BMP兩個批次實驗結(jié)束時，不同S/X條件下的水質(zhì)狀況如表 3所示.兩個批次實驗中隨著S/X增大，pH由弱酸性漸變?yōu)槿鯄A性，分別位于在6.5~7.8、6.7~7.8范圍內(nèi).0#呈弱酸性，可能由未添加基質(zhì)、厭氧污泥自身的水解造成.DH-BMP與AP-BMP實驗結(jié)束時，ORP值分別位于-245~-327 mV與-310~-373 mV范圍內(nèi).隨著S/X比的增大，兩個批次實驗的ORP值都呈下降的趨勢.厭氧環(huán)境的主要標志是發(fā)酵液具有低的ORP，不同的厭氧消化體系和不同的厭氧微生物對ORP的要求不同.通常中溫厭氧消化系統(tǒng)要求的ORP應位于-300~-380 mV之間，產(chǎn)CH4菌最適宜的ORP為-350 mV或更低.DH-BMP實驗樣品的ORP明顯低于對應的AP-BMP實驗樣品值，表明DH-BMP中形成了良好的厭氧生化條件，厭氧污泥的活性高.

表 3 BMP實驗末期不同S/X條件下主要水質(zhì)

　　兩批次實驗中在高S/X條件下溶解性COD(CODs)顯著下降，實驗結(jié)束時CODs基本相同，而未添加外來基質(zhì)的0#樣品中CODs有所提高，可能是厭氧微生物內(nèi)源代謝導致酸化水解從而造成CODs的提高.批次實驗前后，NH3-N濃度均有提高，不同S/X條件下NH3-N變化差異不大，其原因為有機氮的氨化作用造成NH3-N含量的提高，而外來基質(zhì)NaAc的添加對有機氮的降解影響不大.在低S/X條件下(0#)，兩厭氧污泥實驗結(jié)束后VSS/TSS降低，原因可能為厭氧污泥進行內(nèi)源代謝，導致VSS/TSS降低.而在高S/X比條件下，VSS/TSS略有提高這可能是由于厭氧微生物生長緩慢，而實驗持續(xù)時間較短造成.

　　CH4回收率表示該實驗中生成CH4的COD還原值與實驗前后COD降低值的比值.AP-BMP中隨著S/X的增大，CH4回收率也隨之提高，但最高回收率只有52%.其原因推測為AP厭氧污泥中產(chǎn)CH4菌的濃度低、活性差，基質(zhì)以其它的形式代謝.DH-BMP中1#、2#樣品的CH4回收率接近100%，可能由DH厭氧污泥中產(chǎn)CH4菌代謝活躍造成，0#樣品由于未添加基質(zhì)，CH4回收率為43%，主要進行微生物的內(nèi)源代謝，3#、4#樣品中CH4回收率在80%以上，均高于AP-BMP實驗中的對應回收率.

　　3.3 厭氧污泥生物多樣性分析

　　如圖 3所示，兩廠的厭氧污泥中產(chǎn)CH4菌的組成存在著一定的差異.AP廠厭氧消化池中的厭氧污泥Diverse菌群相對豐度達45%，產(chǎn)CH4功能菌主要以產(chǎn)CH4髦毛菌Methanosaeta spp.(280 bps)為主，同時存有少量的產(chǎn)CH4微菌Methanomicrobiaceae(80 bps)、RC-I(389 bps)和產(chǎn)CH4桿菌Methanobacteriaceae(88 bps).同時，DH厭氧消化池中的厭氧污泥產(chǎn)CH4功能菌相對豐度高，Diverse菌群相對豐度僅為7%.產(chǎn)CH4功能菌主要以產(chǎn)CH4髦毛菌Methanosaeta spp.(280 bps)為主，同時存在產(chǎn)CH4微菌Methanomicrobiaceae(80 bps)、RC-I(389 bps)和產(chǎn)CH4桿菌Methanobacteriacea(88 bps).DH污水廠的進水是由完整的市政下水道收集的生活污水，污水中有機含量高，可生化降解性能強，為厭氧消化提供了良好的條件，從而造成了DH厭氧消化池中厭氧污泥產(chǎn)CH4功能菌群豐度較高.

　　圖 3 AP、DH厭氧污泥中主要T-RFs豐度對比

　　3.4 SEM鏡檢結(jié)果

　　SEM鏡檢AP、DH厭氧污泥結(jié)果如圖 4所示.AP厭氧污泥鏡檢中發(fā)現(xiàn)了較為稀疏的髦毛菌，同時還存在著1~2 μm的短桿菌、7~10 μm的長桿菌和直徑為2 μm的產(chǎn)CH4微粒菌.這些菌群較為分散，菌群間的協(xié)同作用不強.DH厭氧污泥菌群與AP污泥相比豐富多樣，在基質(zhì)上依附著大量的髦毛菌，與T-RFLP檢測的結(jié)果較為吻合.同時還存在著1~2 μm的短桿菌、7~10 μm的長桿菌和雙疊球菌等常見的產(chǎn)CH4菌.這些產(chǎn)CH4菌互相交錯、依賴形成了豐度較高的產(chǎn)CH4菌群，與DH厭氧污泥實驗的較佳的產(chǎn)CH4活性相吻合.具體參見污水寶商城資料或http://m.dongaorq.cn更多相關技術(shù)文檔。

　　圖 4 AP和DH厭氧污泥SEM鏡檢

　　4 結(jié)論

　　1)AP、DH兩厭氧污泥采用改進的Gompertz模型回歸的最大比產(chǎn)氣速率數(shù)值接近，分別達到了67.93、62.65 mL · g-1 · d-1(以VSS計)，但對基質(zhì)NaAc的半飽和常數(shù)Km差異較大，分別為1517和801 mg · L-1，DH厭氧污泥對基質(zhì)的親和力高.

　　2)BMP實驗最終的水質(zhì)變化表明，DH-BMP厭氧污泥中的ORP位于-310~-373 mV之間，低于AP-BMP樣品中對應的ORP.在投加基質(zhì)的條件下，DH厭氧污泥的CH4回收率高于80%，高于AP厭氧污泥的CH4回收率.在高S/X條件下，BMP實驗結(jié)束后VSS/TSS略有提高.

　　3)兩厭氧污泥T-RFLP和SEM鏡檢結(jié)果與其生化產(chǎn)CH4勢較為吻合，AP厭氧污泥中產(chǎn)CH4功能菌菌群稀疏且Diverse菌群相對豐度達45%，而DH厭氧污泥中產(chǎn)CH4功能菌種群密集，Diverse菌群豐度僅為7%.DH厭氧污泥中產(chǎn)CH4功能菌以產(chǎn)CH4髦毛菌Methanosaeta spp.(280 bps)為主，同時存在產(chǎn)CH4微菌Methanomicrobiaceae(80 bps)、RC-I(389 bps)和產(chǎn)CH4桿菌Methanobacteriacea(88 bps).

　　4)大量剩余污泥的產(chǎn)生是活性污泥工藝面臨的一個重要問題.后續(xù)可采用剩余污泥為基質(zhì)，采用BMP的實驗方法，考察污泥消化減量過程中產(chǎn)氣性能、產(chǎn)甲烷功能菌群的動態(tài)變化及水質(zhì)變化情況，為剩余污泥厭氧消化工藝性能優(yōu)化提供基礎數(shù)據(jù).