部分亞硝化-厭氧氨氧化（partialnitritation-ANAMMOX，PN/A）顆粒污泥是一種新型自養生物脫氮技術，其主要利用好氧氨氧化菌（AOB）和厭氧氨氧化菌（AMX）在顆粒內外層的協同共生，將進水中氨氮（NH4+-N）大部分轉化為氮氣并生成少量硝酸鹽，反應式如式（1）和式（2）所示：

PN反應：

ANAMMOX反應：

與傳統活性污泥法相比，PN/A顆粒污泥具有脫氮效能高、曝氣耗氧量低、不依賴外部碳源和剩余污泥產量少等優勢，已廣泛用于垃圾滲濾液、污泥消化液和低C/N污廢水處理領域。例如，采用序批次方式運行的荷蘭Nereda®工藝已經在全球建成了50多座工程化設施，日處理能力達到數萬至數十萬噸不等，出水總氮濃度可達到8mg·L-1以下。在國內，河北省某市政污水處理廠利用PN/A顆粒污泥技術，成功對處理規模為2.5萬m3·d-1的原AAO系統進行了改造升級，并實現了穩定運行。與序批次反應器相比，連續流反應器具有操作運行簡單、池容利用率高和便于現有工藝改造等優勢，因而成為目前的研究熱點。

通常認為，接種污泥性質、反應器運行模式和操作條件是影響好氧顆粒污泥反應器啟動的關鍵因素。眾多實驗性和模型研究結果表明，與絮狀污泥相比，接種顆粒污泥能夠更有效地截留功能菌，促進形成生態位分化，從而大幅壓縮連續流反應器的啟動時長。前期研究發現，通過接種PN顆粒污泥，并采用高進水氨氮負荷、高水力選擇壓和限制性曝氣策略，可以在150d內成功啟動連續流PN/A顆粒污泥反應器。PN/A污泥較長的培養周期主要受制于AMX緩慢的倍增時間（5~11d）和嚴苛的生長條件。相比之下，PN顆粒污泥可以通過接種活性污泥在30d內實現批量化培養，AOB的大量富集也為AMX創造了適宜的缺氧環境和充足的亞硝態氮（NO2--N）供給。因此，PN顆粒污泥可以視為培養PN/A污泥的優良前驅體，目前將其用于連續流反應器的快速啟動仍鮮見報道。

在本研究中，按照不同比例將PN與PN/A顆粒污泥混合接種至完全混合流反應器（CSTR）中，通過設置高氨氮負荷和高水力選擇壓條件，嘗試啟動全自養脫氮顆粒污泥反應器。通過建立反應器脫氮效能、顆粒污泥活性與微生物群落結構之間的關聯性，系統闡述了接種污泥中脫氮功能菌群的重構與自適應機制，并提出了一種快速啟動連續流PN/A反應器的可行策略。

1、材料與方法

1.1 反應器與接種污泥

本試驗采用3個結構相同的CSTR反應器（R1、R2和R3），結構如圖1所示。反應器的反應區有效容積為1.5L，兩側設有氣升內回流區，底部裝有微孔曝氣裝置，提供運行時需的溶解氧和水力剪切力，運行溫度通過水浴箱控制在（30±2）℃。

接種采用的PN/A顆粒污泥取自實驗室規模的全自養脫氮反應器，顆粒呈紅棕色，平均粒徑為（1.5±0.2）mm，污泥沉降指數（SVI5）約26mL·g-1，比總氮去除速率（sNRR，以VSS計）約為0.2g·（g·d）-1.接種采用的PN顆粒污泥取自進水低C/N（2∶1）的序批式反應器，顏色呈棕黃色，平均粒徑為（0.8±0.3）mm，SVI5約52mL·g-1，亞硝化積計速率（以VSS計）可達到0.3g·（g·d）-1.

1.2 反應器運行方法

反應器啟動時，按照質量比3∶1、1∶1和1∶3將PN/A與PN顆粒污泥混合接種至R1、R2和R3中，初始污泥濃度（MLVSS）控制在5.97g·L-1，如圖1所示。反應器進水采用人工配置的高氨氮模擬廢水，分別以碳酸氫鈉和氯化銨作為碳氮源，進水水質組成為：750mg·L-1NaHCO3、200mg·L-1NH4+-N、44mg·L-1KH2PO4、20mg·L-1MgSO4·7H2O、0.15mg·L-1FeCl3·6H2O和1.0mg·L-1的微量元素，pH控制在8.0±0.1.

反應器運行主要分為兩個階段：在第Ⅰ階段（1~49d），進水氮負荷（NLR）約為2.4kg·（m3·d）-1，水力停留時間（HRT）為2h，控制曝氣通量在0.7~0.9L·（m2·min）-1，反應區DO濃度1.6~1.9mg·L-1.在第Ⅱ階段（50~95d），保持進水NH4+-N濃度不變，縮短HRT至1.5h，NLR提高至3.2kg·（m3·d）-1，將曝氣通量調至1.1L·（m2·min）-1，DO濃度為1.8~2.1mg·L-1.反應器運行期間不排泥，平均泥齡約為45d。

1.3 分析方法

NH4+-N、NO3--N、NO2--N、TN和MLVSS濃度分別采用納氏試劑光度法、紫外分光光度法、N-（1-萘基）-乙二胺光度法、過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法和標準重量法測定。SVI5值采用國家規定的標準方法測定。

使用帶高清攝像頭的光學顯微鏡觀察污泥形態。粒徑分布采用篩分法測算。定期從反應器中取出污泥樣品，經生理鹽水反復清洗后，依次通過孔徑1.60、1.25、0.80、0.50和0.20mm的分樣篩，并計算各粒徑區間樣品所占的質量分數。

f值是判斷PN/A反應的重要計量學指標，計算見式（3）：

式中，Δc（NO3--N）和Δc（NH4+-N）分別為反應器進出水中NO3--N和NH4+-N濃度差的絕對值，mg·L-1；由式（1）和式（2）可知，f的理論值為0.11.

1.4 微生物高通量測序分析

采集接種污泥（PN0和PNA0）和第95d不用反應器中的污泥樣品（R1、R2和R3），利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，選擇16SrRNA中338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）為細菌特征引物，使用20μL混合反應體系，在ABIGeneAmp®9700型PCR擴增儀上完成目標片段擴增。隨后，基于IlluminaMiSeqPE300平臺，對PCR擴增產物進行高通量測序，并進行細菌分類學等相關分析。27個樣本的基因序列平均長度為441bp，以97%的相似性截取對操作單元（OTU）進行聚類。每個16SrRNA基因序列的分類通過USEARCH7-uparse算法與silva128/16s_bacteria數據庫進行分析，分類置信度為0.7.基于觀察到的OTU，使用Uparse軟件計算OTU豐富度（ACE指數）和α多樣性指數（Shannon指數），并進行（PCA）主成分坐標分析。在門和屬水平上，比較不同樣品菌群結構的差異性，并且對顆粒污泥主要功能菌種相對豐度進行分析。

2、結果與討論

2.1 反應器的脫氮性能

3個連續流反應器的啟動運行情況如圖2所示。在第1~10d，控制曝氣通量在0.7L·（m2·min）-1，R1出水中ρ（NO2--N）逐步從9.02mg·L-1降至5.81mg·L-1，NH4+-N和TN去除率分別升至63.1%和54.4%，顆粒污泥表現出較高的自養脫氮性能，并產生少量NO3--N。與之相比，更高的PN污泥接種比使得R2和R3呈現明顯的亞硝化特征，出水中NO2--N濃度都經歷了一個“先升后降”的波動過程。運行至第10d，R2和R3的NH4+-N去除率分別為52.0%和53.5%，但TN去除率仍低于40%。在第10~49d，反應器單位曝氣通量調高至0.9L·（m2·min）-1，R1、R2和R3出水中的ρ（NO2--N）分別降至3.8、3.8和13.2mg·L-1，TN去除率逐步提高至80.7%、79.3%和74.5%。

在第50d，通過縮短HRT和調高曝氣量，增大反應器NLR和溶解氧供給（水力剪切），以強化顆粒污泥的脫氮性能。R1和R2在經歷沖擊后，TN去除率在第70d后趨于穩定，分別達到（82.4±2）%和（80.7±2）%。R3出水中ρ（NH4+-N）、ρ（NO3--N）和ρ（NO2--N）濃度在第80d后趨于穩定，均值分別為17.0、2.3和21.0mg·L-1，TN去除率達到（79±2）%。需要注意的是，本研究在CSTR出水中保留了充足的剩余ρ（NH4+-N）（>12.9mg·L-1），保證AOB和AMX對NOB的生長競爭優勢。在第95d，R1~R3的TN去除負荷達到2.6~2.7kg·（m3·d）-1，f值約為0.10±0.02，接近PN/A反應的理論值。這表明3個連續流PN/A顆粒污泥反應器已成功啟動。顆粒污泥反應器脫氮性能與已有研究報道結果的對比如表1所示。

2.2 粒徑分布與污泥活性變化

在啟動初始階段，R1中污泥的平均粒徑和比總氮去除率（以VSS計）分別為1.13mm和0.15g·（g·d）-1，遠大于R2和R3的對應值（圖3）。當運行至第50d，3個反應器中污泥量和sNRR均有所增長，其中，R2的ρ（MLVSS）最大，達到6.78g·L-1，SVI5值保持在21~33mL·g-1的水平。同期，R3中粒徑0.5~0.8mm的污泥占比由最初的51%大幅下降至24%，并出現了粒徑>1.6mm的顆粒污泥（約10%），污泥平均粒徑較接種污泥增大了約17.6%，增幅高于R2的9.4%和R1的3.5%。這意味著接種污泥在高水力剪切的作用下發生了顆粒破碎、表面剝落、小顆粒聚集和生長過程，顆粒粒徑的增大將有利于促進微生物生境的分化，提高物種及其功能的多樣性。Zhu等通過綜合分析顆粒內部傳質、功能菌富集和污泥沉降性等因素，認為處理低濃度廢水時，好氧顆粒污泥的最佳粒徑范圍在0.5~0.9mm。在本研究中，粒徑在0.5~1.25mm的顆粒污泥始終占據主導地位。

在第Ⅱ階段，隨著NLR提高至3.2kg·（m3·d）-1，反應器內污泥量和sNRR進一步增長。在第95d，R1~R3中ρ（MLVSS）分別達到7.3、7.8和7.2g·L-1，sNRR分別較接種污泥提高了約2.4、3.9和9.5倍。從形態上看，3個反應器中污泥的平均粒徑在1.22~1.27mm，粒徑分布總體服從正態分布。顆粒呈現PN/A污泥所特有的棕紅色，表層較內核更為松散，有利于氮素、溶解氧和氮氣的雙向傳質。

2.3 污泥菌群結構對比分析

采用高通量測序技術對不同污泥樣品中的菌群結構進行了分析。盡管PN0與PNA0存在功能性差異，但R1~R3中顆粒污泥在相同條件下培養95d后獲得了類似的菌群結構，如圖4所示。在OTU水平上，R1~R3中顆粒污泥的微生物豐度（Ace指數）和生物多樣性（Shannon指數）均明顯高于接種污泥，擁有與PNA0和PN0相同的OTU數量分別為236個（占比為49.7%~53.6%）和143個（占比為30.1%~32.5%）。這表明功能菌群在反應器啟動期間發生了重構和演化，以適應高NLR、高水力剪切和高水力選擇壓的運行條件。

如圖5（a）所示，R1~R3中顆粒污泥中相對豐度前5的菌門分別為浮霉菌門（Planctomycetes）（23.0%~28.8%）、變形菌門（Proteobacteria）（26.2%~40.0%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（10.3%~16.3%）、擬桿菌門（Bacteroidetes）（10.9%~16.7%）和綠菌門（Chlorobi）（3.1%~4.3%）。與Proteobacteria（50.5%）和Bacteroidetes（30.0%）占主導的PN0相比，R1~R3污泥的菌群結構與PNA0具有更高的相似度。作為PN/A反應的核心功能菌，隸屬于Planctomycetes菌門的CandidatusKuenenia屬是PNA0中主要的AMX菌屬（30.78%）。同時，接種PN0顆粒污泥為反應器提供了充足的AOB菌種（Nitrosomonas屬），有利于AMX在顆粒污泥中的富集。如圖5（b）所示，Nitrosomonas和CandidatusKuenenia在R1~R3污泥中的相對豐度分別達到了1.5%~2.4%和23.6%~37.6%。另外，R1~R3污泥中還檢出了少量r型-AMX菌屬（CandidatusBrocadia，0.3%~0.5%），這可能與反應器啟動初期的亞硝累積過程有關。與CandidatusKuenenia屬相比，CandidatusBrocadia在高基質濃度（如NO2--N）條件下的生長速率更快，并具備更強的小分子有機酸代謝能力。值得注意的是，R1~R3污泥中并未檢出亞硝酸鹽氧化菌（NOB），這說明維持剩余NH4+-N濃度有效抑制了NOB在顆粒污泥中的生長，有利于維持連續流反應器的穩定運行。

盡管R1~R3反應器進水中不含有機碳，但Chloroflexi、Bacteroidetes和Chlorobi等異養菌門在PN/A顆粒污泥中的生長仍是普遍現象，可形成復雜的種間代謝基質（如碳氮源、氨基酸和維生素等）傳遞和利用網絡，例如，隸屬于Chloroflexi門的norank_f_Anaerolineaceae在R1~R3污泥中的相對豐度達到了4.8%~10.4%，其主要通過水解細胞殘體（SMP）和胞外聚合物質（EPS）獲取生長基質，對維持顆粒污泥的穩定發揮了重要作用。同時，Denitratisoma和norank-f-PHOS-HE36等反硝化菌（HDB）的檢出表明，厭氧氨氧化反應并不是顆粒污泥中唯一的生物脫氮路徑。通常認為，污泥水解提供的內源有機碳不足以驅動完全反硝化過程（NO3-→NO2-→N2O→N2），這使得HDB優先將NO3--N還原為AMX生長所需的NO2--N，實現部分反硝化功能。此外，有研究者基于宏基因和宏轉錄測序分析提出，Chlorobi與AMX存在密切的共生關系，一方面，AMX向Chlorobi提供其無法合成的基質，如醋酸鹽、b族維生素和EPS（氨基酸、肽），另一方面，Chlorobi可以從AMX處獲得次級代謝產物和氨基酸等。

2.4 混合接種的工程應用潛力

在本研究中，按照不同質量比混合接種PN/A和PN顆粒污泥，成功啟動了連續流自養生物脫氮工藝，TN去除負荷達到2.6kg·（m3·d）-1以上，遠高于傳統活性污泥法的水平。在此期間，PN顆粒污泥不僅為反應器提供了充足的AOB菌種和AMX生長所需的限制性基質（NO2--N），還可以通過顆粒間碰撞獲得AMX菌種，并逐步形成穩定的PN/A顆粒結構，如圖6所示。在CSTR反應器中，單個PN/A顆粒污泥都可被視為一個微型的污水處理單元，AOB集中分布于顆粒表面0~150μm的外層，而AMX則占據表層以下300~700μm的內核區域。在水力剪切的作用下，顆粒之間的碰撞、摩擦或表層剝離都可能破壞AOB和AMX的分層結構。作為培養PN/A顆粒污泥的前驅體，PN顆粒污泥表面存在穩定的溶氧梯度，并能夠為AMX生長提供充足的NH4+-N和NO2--N供給，經過新的污泥顆粒化過程，就可以形成泥齡更短、活性更高的微生物聚集體。

有研究表明，采用高水力選擇壓的生化反應器，如大高徑比（H/D為8~12）的序批式反應器和短HRT、高污泥截留的連續流反應器，能夠在7~21d內同步實現活性污泥的亞硝化和顆粒化。與PN/A污泥相比，PN顆粒污泥的批量化培養難度明顯更低。在工程化應用中，將PN顆粒污泥與PN/A污泥混合接種是快速啟動連續流反應器的有效方法，具有很強的實用性。

3、結論

（1）當NLR為2.4kg·（m3·d）-1時，R1和R2連續運行至第49d，TN去除率均可達到80%以上，而R3表現出更明顯的亞硝化特性。通過同步提高NLR和曝氣強度，R1、R2和R3在運行至第95d時，TN去除負荷達到2.6kg·（m3·d）-1以上，f值接近理論值0.11.連續流PN/A顆粒污泥反應器成功啟動。

（2）在反應器啟動期間，顆粒污泥濃度和脫氮活性均持續提高。運行至第95d，R1~R3中污泥的ρ（MLVSS）、平均粒徑和sNRR值（以VSS計）分別達到了7.1~7.8g·L-1、1.22~1.27mm和0.35~0.39g·（g·d）-1。盡管R3中顆粒污泥的平均粒徑和脫氮活性增幅最大，但PN/A與PN顆粒污泥的接種比并未顯著影響反應器在穩定狀態下的脫氮性能。

（3）高通量測序結果表明，R1~R3中顆粒污泥的微生物豐度和多樣性指數均明顯高于接種污泥。在顆粒污泥中，AOB（Nitrosomonas屬）和AMX（CandidatusKuenenia和Brocadia屬）是驅動PN/A自養脫氮的核心菌群，同時，Chloroflexi、Bacteroidetes和Chlorobi等異養菌的協同生長也為增強顆粒功能結構的穩定性發揮了重要作用。啟動期間，PN顆粒污泥充當了培養PN/A污泥的前驅體，因此，混合接種策略對快速啟動連續流自養脫氮工藝具有較高的工程指導意義。（來源：蘇州科技大學環境科學與工程學院，城市生活污水資源化利用技術國家地方聯合工程實驗室，蘇州太湖中法環境技術有限公司）