當前, 隨著畜禽養殖業的集約化、規模化發展, 獸用抗生素被廣泛用于預防和治療動物疾病.據統計, 全球獸用抗生素用量是人用抗生素用量的2倍.據報道, 2012年美國獸用抗生素的使用量為1.46×104 t;在2013年中國抗生素使用量達1.62×105 t, 其中52%被用于畜禽養殖業.雖然獸用抗生素能有效預防和治療動物疾病, 但不能被動物完全吸收和代謝.Massé等的研究發現, 約70% ~90%的獸用抗生素以原始形態或代謝產物的形式通過糞便和尿液排出.Zhou等和Jiang等已在養豬場廢水、糞便和廢水處理過程中產生的污泥中檢測到殘留抗生素.然而, 當前養殖場廢水處理設施主要針對廢水中常規污染物的削減而設計, 并未考慮抗生素的去除, 這使得殘留抗生素不斷從養殖場排出, 最終進入自然環境.Tasho等的研究發現, 進入土壤中的抗生素不僅可以通過殺死植物根際微生物來改變土壤微生物的結構和功能, 而且還能增加土壤中抗性基因(ARGs)發生的頻率和豐度.同時, 殘留在土壤和水體中的抗生素可通過食物鏈或飲用水途徑進入人體, 誘導體內病原體產生抗性, 從而降低抗生素治療疾病的能力.因此, 最大限度地削減殘留在養豬場廢水中的抗生素成為當前研究者關注的焦點.

　　當前, 國內大多數養豬場只配備簡單的處理設施, 如氧化塘和厭氧消化池.而有研究發現養殖場中的氧化塘和厭氧消化池不能有效去除廢水中的抗生素.近年來, 一些養豬場開始使用更先進的廢水處理單元, 如上流式厭氧污泥床(UASB)和厭氧+好氧氧化、膜生物反應器(MBR)、超濾(UF)和納濾(NF), 然而當前關于這些處理單元組合的處理工藝對廢水中抗生素的去除報道較少.同時目前關于貴州養豬場廢水中抗生素的研究主要集中在養豬場污灌區域土壤中重金屬和抗生素的復合污染狀況, 而關于探討養豬場廢水處理工藝中各處理單元對廢水中抗生素的去除鮮見報道.故本研究選取貴州2家規模化養豬場廢水中10種獸用抗生素(6種磺胺類抗生素、3種四環素類抗生素和1種喹諾酮類抗生素)進行調查, 分析養豬場廢水中抗生素的污染特征及其在處理單元中的去除效果, 以期為規模化養殖業中獸用抗生素的污染控制及環境治理提供理論參考.

　　1 材料與方法

　　1.1 儀器與試劑

　　LC-MS(LC:Agilent Technologies 1290 Infinity;MS:AB SCIEX QTRAP 6470, 美國Agilent公司);色譜柱(ZORBAX Eclipse Plus C18 1.8 μm 3.0×50 mm Column, 美國Agilent公司);固相萃取裝置(24孔, 美國Waters公司);HLB固相萃取小柱(6 mL/500 mg, 美國Waters公司);電子天平(中國上海儀天科學儀器有限公司);旋轉蒸發儀(德國Heidolph公司).

　　抗生素標準品包括3種四環素類(TCs)抗生素：鹽酸四環素(tetracycline hydrochloride, TC)、土霉素(oxytetracycline dihydrate, OTC)和金霉素(chlorotetracycline hydrochloride, CTC), 6種磺胺類(SAs)抗生素：磺胺對甲氧嘧啶(sulfameter, SMD)、磺胺甲基唑(sulfamethoxazole, SMX)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine, SMM)、磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine, SMZ)、磺胺吡啶(sulfapyidine, SPD)和磺胺嘧啶(sulfadiazine, SD), 1種喹諾酮類(FQs)抗生素：氧氟沙星(ofloxacin, OFL), 購置于百靈威科技有限公司, 純度均大于95.0%.甲醇和氨水(色譜純)均購置于德國的MERCK公司, 乙二胺四乙酸二鈉、磷酸和磷酸二氫鈉(分析純)購置于百靈威科技有限公司.實驗用水為超純水(Milli-Q超純水系統, 美國Waters公司), 0.45 μm玻璃纖維濾膜購自Millipore公司, 0.22 μm有機針孔濾膜購置于南京榮華科學器材有限公司.

　　10種抗生素標準品先分別以甲醇為溶劑配制為1 000 mg ·L-1的標準儲備液, 然后再以甲醇作為溶劑, 將標準儲備液配制為10 mg ·L-1的混合標準物質的儲備液, 均存儲在-20℃冰箱中, 備用.

　　1.2 樣品的采集

　　選取2種不同處理工藝的規模化養豬場(豬場A和豬場B)為研究對象. 2家養豬場的存欄量均為5 000頭(母豬), 場內配備有廢水處理設施, 處理規模均為200 m3 ·d-1. 2019年4月對這2家養豬場按廢水處理工藝流程采集樣品, 豬場A的處理工藝為“固液分離+物化沉淀+USR(升流式固體厭氧反應器)+2級A/O+消毒池+氧化塘”, 出水最終排向周邊農耕地;豬場B的處理工藝為“厭氧發酵+SBR生化+超濾(UF)+納濾(NF)”, 出水最終排向周邊水體.豬場A共采集12個樣品, 豬場B共采集6個樣品, 具體采樣點如圖 1所示.每個采樣點分別采集2次并混合均勻, 每次采集1.0 L, 共采集2.0 L.所有采集水樣均為瞬時水樣, 使用有機玻璃采水器采集表層水樣, 儲存在預先洗凈的采樣瓶中, 低溫避光保存, 并盡快運回實驗室, 保存在4℃的冰箱內待測.

圖 1 養豬場糞污處理工藝及取樣點設置示意

　　1.3 分析方法

　　1.3.1 常規指標的分析

　　廢水中常規指標包括：pH、化學需氧量(COD)、氨氮(NH4+-N)、總氮(TN)和總磷(TP).pH采用PHSJ-3F計(上海精科雷磁化學儀器公司)進行測定;NH4+-N采用納氏試劑光度法測定;TN采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法測定;TP采用鉬酸銨分光光度法測定;COD采用快速消解分光光度法測定.

　　1.3.2 抗生素的分析

　　樣品前處理：水樣經0.45 μm的玻璃濾膜過濾去除小顆粒物, 然后用磷酸水溶液調節水樣pH約為3, 每200 mL水樣加入1 mL的Na2EDTA(100 g ·L-1), 用HLB小柱進行富集, 流速控制在3~5 mL ·min-1.富集前, 依次用6 mL甲醇、3 mL超純水、6 mL pH約為3的磷酸-磷酸二氫鈉水溶液(100 g ·L-1)活化小柱.富集完成后用6 mL超純水淋洗, 負壓真空干燥40 min后依次用6 mL甲醇、6 mL 2%氨水甲醇(體積比)洗脫HLB小柱, 洗脫液用雞心瓶接收.洗脫液在45℃下旋蒸至干, 然后用甲醇溶液定溶至1 mL, 渦旋振蕩1 min后, 待LC-MS分析.

　　LC檢測條件：柱溫40℃, 流速0.2 mL ·min-1, 流動相A為0.1%甲酸水+2 mmol ·L-1乙酸銨, 流動相B為乙腈, 進樣體積2 μL, 梯度洗脫(洗脫分離步驟見表 1).LC-MS質譜測定條件：采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式、多反應離子監測掃描定量分析目標物.

 表 1 梯度洗脫分離步驟

　　1.4 質量控制

　　采用外標法對樣品進行定量分析, 以8個不同梯度的標準物質溶液作定量曲線, 線性方程濃度范圍為0~200 μg ·L-1, 相關系數(R2)值均大于0.995.同時為了保證實驗數據的可靠性, 本次實驗設置回收率實驗.在不含目標化合物的超純水水樣(100 mL)中添加抗生素標準溶液, 按照前述樣品處理方法對樣品進行前處理.經檢測空白水樣中目標物回收率為80.06% ~138.43%, 相對標準偏差為1% ~10.65%, 目標抗生素的檢出限為0.034~1.40 ng ·L-1.

　　1.5 抗生素去除率的計算

　　抗生素的去除率計算公式如下式所示[11]：

　　式中, AR是每種抗生素的水相去除率, %;cinf為處理單元進水中抗生素濃度, ng ·L-1;cenf為處理單元出水中抗生素濃度, ng ·L-1.

　　1.6 數據處理

　　用Excel 2013對實驗數據進行處理和分析, 采用Origin 9.1和Canoco 5軟件進行作圖.

　　2 結果與討論

　　2.1 養豬場廢水處理工藝各處理單元對常規水質指標的削減情況

　　2家規模化養豬場廢水處理工藝各處理單元對常規水質指標的削減情況如表 2所示.豬場A和豬場B的廢水處理工藝對廢水中常規污染物(COD、NH4+-N、TN和TP)的去除率分別為97.10% ~99.75%和88.10% ~98.10%.整體而言, 對廢水中COD的去除, 豬場A優于豬場B;在豬場A的USR反應池中對COD的去除貢獻最大, 豬場B廢水處理中生物預處理池、SBR生化反應池及UF處理單元對COD的去除效果較好.在豬場B中, NH4+-N和TN僅在NF處理單元被有效去除, 這可能是由于納濾膜孔徑和膜表面電荷的共同作用.在豬場A的USR反應池TP的濃度高于上一級處理單元, 這可能是因為USR反應池處于厭氧環境, 聚磷菌會在此環境下打開體內聚合磷酸鹽的高能磷酸鍵, 從而釋放出磷, 使得USR反應池中磷酸鹽濃度增加.在豬場A的出水中COD、NH4+-N、TN和TP的濃度均滿足《畜禽養殖業污染物排放標準》(GB 18596-2001)的要求;在豬場B的出水中僅TP指標滿足GB 18596-2001的要求, 其余3項指標均超標, 故仍需進行后續處理.綜上, 豬場A廢水處理工藝對廢水中常規污染物的去除效果優于豬場B.

  表 2 養豬場廢水處理工藝各處理單元對常規水質指標的削減情況

　　2.2 目標抗生素在各處理單元水相中的殘留情況

　　養豬場廢水處理單元水相中抗生素的殘留情況如圖 2所示.在豬場A廢水處理工藝的廢水中, 共檢出6種抗生素, 包括3種SAs、2種TCs和1種FQs類抗生素, 濃度范圍在ND~47 029.25 ng ·L-1之間.SAs類抗生素中SMM和SMD的檢出率較高, 均為58.33%, 其中, SMM在原水池、調節池、物化沉淀池、USR反應池、二級生化沉淀池和消毒池中的殘留濃度較高, 濃度分別為3 338.82、4 955.09、11 561.13、6 450.26、47 029.25和1 770.93 ng ·L-1, 這與周婧等的研究結果相似.TCs類抗生素中OTC在廢水中的檢出率為91.67%, 濃度范圍在ND~37 976.04 ng ·L-1之間, 其中在進水處的檢出濃度最高;同時也發現OTC是豬場A廢水中被檢出濃度最高的抗生素, 這與Ben等的研究結果相似, 表明在豬場A中OTC的使用量較大.TC在廢水進水中未檢出, 而在出水中被檢出, 這可能是因為進水中存在目標抗生素的代謝產物, 隨后在生物處理過程中轉化為其母體化合物[15].FQs類抗生素中OFL在各處理單元中的檢出率為83.33%, 濃度在ND~22 714.43 ng ·L-1之間, 這可能是由于OFL在廢水中的降解速率較慢和在廢水中的累積效應所導致.整體而言, 豬場A廢水處理工藝中抗生素殘留規律為OFL(136 157.92 ng ·L-1)>OTC(117 472.08 ng ·L-1)>SMM(66 837.02 ng ·L-1)>SMD(60 109.32 ng ·L-1)>TC(9 611.92 ng ·L-1)>SD(91.87 ng ·L-1), 在二級生化沉淀池處的濃度最高, 總濃度達124 151.44 ng ·L-1.

 圖 2 豬場廢水處理單元出水中抗生素的含量

　　在豬場B廢水處理工藝中, 共檢出7種抗生素, 包括4種SAs、2種TCs和1種FQs類抗生素, 濃度范圍為ND~120 842.74 ng ·L-1.SAs類抗生素中SD、SMD和SMM的檢出率分別為66.67%、100.00%和100.00%, 在厭氧發酵池出水處3個物質均被檢出, 濃度分別為81.09、108 730.47和120 842.74 ng ·L-1, 高于陳永山等的研究.TCs類抗生素中OTC的檢出率為100%, 這與Wang等[12]的研究結果相似;TC僅在出水處被檢出、OFL僅在UF和出水處檢出, 這可能是由于廢水中TC和OFL的共軛形態向游離形態轉化的結果.整體而言, 豬場B廢水處理工藝中抗生素的殘留規律為SMM(357 427.75 ng ·L-1)>SMD(321 614.68 ng ·L-1)>OTC(71 756.52 ng ·L-1)>OFL(23 094.08 ng ·L-1)>SD(278.55 ng ·L-1)>TC(110.76 ng ·L-1), 在厭氧發酵池出水處的總濃度最高, 達251 123.56 ng ·L-1.

　　在2家豬場廢水處理工段中, SPD、SMX、SMZ和CTC均未被檢出, 而SMZ和CTC在陳永山等[24]的研究中均被檢出, 這可能是由于不同地區養殖場對獸用抗生素的利用模式差異所致.同時發現在2家養豬場廢水中OTC的檢出濃度均較高, 這與其它地區養豬場和養牛場廢水中OTC的殘留情況相似, 表明OTC為大部分養殖場所熱衷使用的抗生素.

　　2.3 不同處理單元對養豬場廢水中抗生素的去除效果

　　養豬場廢水處理單元中抗生素的去除情況如表 3所示.在豬場廢水處理工藝的一級處理過程中, 豬場A對∑SAs、∑TCs和∑FQs的去除率分別為-244.81%、64.29%和-0.11%.其中對SMM、SMD和OFL的去除均出現負遷移現象(除在物化沉淀池對OFL的去除為正外), 這可能是由于廢水中細小的糞便或顆粒包裹進水中部分抗生素(SMM、SMD和OFL), 在處理單元中被微生物破壞了抗生素與糞便或顆粒之間的屏障, 從而增加該處理單元中SMM、SMD和OFL的濃度.而對OTC的去除均為正向去除, 其中在調節池中的去除率較高, 為57.69%, 這可能是因為在調節池處理單元時, OTC的去除除通過污泥吸附外, 還可能通過光降解、水解等途徑進行降解.

 表 3 豬場各處理單元中抗生素的水相去除率 /%

　　在二級處理中, 豬場A廢水處理工段對∑SAs、∑TCs和∑FQs的去除率分別為-306.13%、-86.18%和100.00%.在USR反應池、一級缺氧池和二級缺氧池中, 對SMM、SMD和SD的去除效果較好(去除率為44.21% ~100.00%), 原因可能是SMM、SMD和SD分子結構中存在氮原子和硫原子, 在厭氧條件下易于生物降解.據報道SAs類抗生素的pKa比較低, 在酸性條件下帶正電, 而在堿性條件下帶負電.豬場A的二級處理過程中廢水的pH均大于7, 然而SAs類抗生素又屬于高親水化合物, 很難從水相轉移到污泥相, 因此在此階段中豬場廢水中SAs類抗生素的去除主要以生物降解為主.TCs類抗生素的lgKd值在3.7~4.1 L ·kg-1之間, 易被污泥所吸附, OTC在二級處理工段中的去除效果不佳, 其中在USR反應池和二級生化沉淀池中出現負遷移現象, 這可能是因為污泥相中吸附的OTC解吸到水相.當廢水中pH在7.00~10.00范圍時, 含有帶正電荷的氮原子或二甲氨基團易與帶負電荷的污泥吸附在一起, 這是USR反應池和二級生化沉淀池去除OFL的途徑之一.豬場B廢水處理工段對∑SAs和∑TCs的去除率分別為-41.73%和60.78%, 在厭氧發酵池和SBR生化反應池處理單元中, 對SD、SMM和SMD的去除出現負遷移現象, 這可能是由于SD、SMM和SMD的乙酰化代謝物在生物處理過程中發生生物轉化的結果.在厭氧發酵池、生物預處理池和SBR生化反應池對OTC的去除均為正去除, 其原因可能是3個反應池中污泥對OTC的吸附作用較好.同時據報道沼氣工程中的微生物可以以抗生素作為碳源進行代謝, 從而促進抗生素的去除, 這可能是厭氧發酵池中OTC去除效果較好的原因之一.具體聯系污水寶或參見http://m.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　在豬場A和豬場B的三級處理中對∑SAs和∑TCs的去除率分別為100.00%、99.86%和99.89%、98.25%.其中在豬場A的氧化塘處理單元中, 對SMM、SMD和OTC的去除率均為100.00%, 這可能是由于氧化塘處理單元中廢水的水力停留時間長, 較長的水力停留時間能延長抗生素和微生物的接觸時間, 同時也能延長植物對抗生素吸收的時間, 有利于對抗生素的去除.在豬場B的UF處理單元中對SD、SMM和SMD的去除率高于88.13%.NF對目標抗生素的去除率均高于99.23%, 表明NF能有效去除豬場廢水中的抗生素;這可能是因為NF的膜孔徑一般小于2 nm, 能夠有效截留水中的抗生素.同時已有研究表明, 多種膜處理技術組合能更好地去除廢水中的抗生素.

　　綜上, 從對目標抗生素的去除效果而言, 豬場A的“固液分離+物化沉淀+USR+二級A/O+消毒池+氧化塘”處理工藝優于豬場B的“厭氧發酵+SBR生化反應+UF+NF”處理工藝.豬場A廢水處理工藝去除效果較好的原因歸因于“USR+2級A/O”處理工段的生物降解和氧化塘處理單元中的水力停留時間較長;豬場B廢水中抗生素的去除大部分歸因于UF和NF的組合工藝的去除.同時發現2家豬場廢水處理工藝對獸用抗生素的去除效果都較好(總去除率>99.23%).但最終出水中獸用抗生素的濃度大部分都高于歐盟水環境抗生素閾值(10 ng ·L-1), 因此, 最終出水中殘留的獸用抗生素排放可能會引起一系列的環境風險需要引起高度重視.

　　2.4 常規指標與抗生素之間的相關關系

　　采用冗余分析(RDA)分析了2家規模化養豬場廢水的常規指標(COD、NH4+-N、TN、TP和pH)與廢水中抗生素之間的關系, 結果如圖 3所示.豬場A和豬場B的廢水中常規參數與抗生素在第1軸、第2軸的解釋量分別為79.10%、19.17%和97.04%、2.11%, 累計解釋量分別為98.27%和99.15%, 由此可見前兩軸能夠很好地反映廢水常規指標與抗生素之間的關系, 且主要由第1軸決定.在豬場A中, pH與TC、SMD和SMM呈正相關, 與OFL和OTC呈負相關;COD、NH4+-N、TN和TP與OTC和OFL呈正相關, 與TC、SMD和SMM呈負相關.在豬場B中, pH與TC和SMX呈正相關, 與SMD、SMM、SD和OTC呈負相關;COD、NH4+-N、TN和TP與SMD、SMM和OTC呈正相關, 與OFL、TC和SMX呈負相關.綜上, 表明廢水中常規指標(COD、NH4+-N、TN、TP和pH)與抗生素的降解具有相關性, 其中NH4+-N與OTC、pH與TC具有較大的正相關性, COD、NH4+-N、TN和TP與TC呈負相關性, pH與OTC呈負相關性, 這可能意味著部分抗生素會隨著微生物對有機物的生物降解而降解.但是, 在各處理單元中抗生素的去除機制還有待進一步研究.

 圖 3 養豬場廢水中常規指標與抗生素之間的關系

　　3 結論

　　(1) 2家規模化養豬場(豬場A和豬場B)廢水處理工藝對常規污染物(COD、NH4+-N、TN和TP)的去除率在88.10%以上, 豬場A出水中COD、NH4+-N、TN和TP均滿足《畜禽養殖業污染物排放標準》(GB 18596-2001)的要求, 而豬場B出水中僅TP滿足GB 18596-2001的要求.

　　(2) 目標抗生素在不同的養豬場和不同的廢水處理單元中的殘留情況不盡相同, 豬場A和豬場B的廢水處理工藝中抗生素的殘留規律分別為：OFL>OTC>SMM>SMD>TC>SD和SMM>SMD>OTC>OFL>SD>TC.主要的污染單體為SMM、SMD、OTC和OFL, 最高單體污染濃度達120 842.74 ng ·L-1(SMM).

　　(3) 2家養豬場廢水處理工藝對獸用抗生素的去除效果都較好(總去除率>99.23%).豬場A廢水處理工藝中“USR+2級A/O+消毒池+氧化塘”組合工段能有效去除廢水中的抗生素, 其中對SMD、SMM和OTC的去除率均達100%;在豬場B廢水處理工藝中, “UF+NF”組合工段對目標抗生素的去除效果較好, 最終廢水中99.23%以上的抗生素被去除.總體上, 去除效果豬場A廢水處理工藝優于豬場B.

　　(4) 通過冗余分析發現, 在2家養豬場廢水中, pH與TC均呈正相關關系、與OTC呈負相關關系;COD、TN、NH4+-N和TP與OTC呈正相關關系、與TC呈負相關關系.(來源：貴州大學資源與環境工程學院 作者：楊釗)