厭氧氨氧化作為新型生物脫氮工藝具有節約能耗、污泥產量低、脫氮效率高等優點，已經成功應用于污泥水、滲濾液等高氨氮廢水處理。而如何將厭氧氨氧化應用于城鎮污水的脫氮處理是目前國內外的研究熱點。實現厭氧氨氧化反應的前提是獲得穩定的亞硝酸氮作為電子受體，而城鎮污水中氨氮濃度低(20~45 mg·L−1)，出水水質要求高，通過低溶氧、游離氨或游離亞硝酸抑制等傳統方法很難實現穩定的部分亞硝化(partial nitrification)，且部分亞硝化與厭氧氨氧化聯用技術仍不能解決出水中含有大量硝態氮的問題。因此，有研究提出將部分污水中的氨氮首先完全硝化為硝酸鹽氮，然后將硝酸鹽氮還原為亞硝酸鹽氮，從而為厭氧氨氧化的實現提供穩定的電子受體，有望成為未來城鎮污水高效低耗脫氮處理工藝，于是對城鎮污水的厭氧氨氧化脫氮研究轉化為如何將硝酸鹽還原與厭氧氨氧化進行高效地耦合。目前認為可能的途徑有3條：1)利用厭氧氨氧化菌自身可進行部分硝酸鹽異化還原(DNRA)的partial DNRA-anammox耦合工藝;2)利用反硝化甲烷古菌進行部分反硝化(DAMO)的DAMO-anammox耦合工藝;3)利用異養反硝化菌進行部分反硝化(partial denitrification)的partial denitrification-anammox耦合工藝。
DNRA-anammox耦合工藝與DAMO-anammox耦合工藝存在控制困難、氧化速率慢、效率低、功能微生物難富集等問題，在實際污水脫氮中的應用還有一定的難度。在反硝化過程中，亞硝酸鹽積累是一個普遍存在的現象，可通過選擇合適的碳源、控制適宜的碳氮比和反應時間等條件，較易篩選出將硝酸鹽僅還原到亞硝酸鹽的部分反硝化異養菌，實現亞硝酸鹽的穩定積累。部分反硝化與厭氧氨氧化技術聯用可以實現同步脫氮除碳，避免了出水中硝酸鹽的積累，同時通過部分反硝化途徑為厭氧氨氧化反應提供了亞硝酸鹽，具有操作簡單、運行穩定等優點，有望實現厭氧氨氧化技術在城鎮污水處理主流工藝中的應用。
本研究以接種具有高效部分反硝化能力的部分反硝化菌(Thauera)和厭氧氨氧菌(Candidatus Brocadia)在同一反應器中形成耦合系統，以乙酸鈉為碳源，在COD/NO3−-N比為2.5，進水NO3−-N/NH4+-N比為1.2的條件下，通過2種污泥的活性計算，使得接種到耦合系統的2種污泥能同時發生部分反硝化與厭氧氨氧化反應，以達到在低COD情況下可同時去除氨氮與硝酸鹽的目的。
1 材料與方法
1.1 接種污泥
厭氧氨氧化接種污泥取自穩定運行5年的SBR，總氮(TN)去除負荷為1.7 kg·(m3·d)−1，TN去除率為(89.87±0.43)%，污泥呈紅棕色，顆粒化程度良好。宏基因組測序[12]結果表明污泥中的優勢菌為Candidatus Brocadia (34.1%)。
部分反硝化接種污泥取自穩定運行1年的SBR，進水COD/NO3−-N比為2.5，NO3−-N濃度為50 mg·L−1，NO2−-N的積累率穩定在95%。宏基因組測序結果表明，污泥中的優勢菌為Thauera (71.85%)。
1.2 實驗裝置與運行方式
實驗裝置為工作容積1 L的SBR，通過恒溫水浴控制反應器溫度為30 ℃左右。實驗方式分為批式實驗和連續實驗。批式實驗分4批進行，各批次的厭氧氨氧化菌和部分反硝化菌的污泥濃度及進水條件相同，但NO3−-N/NH4+-N比不同，考察不同NO3−-N/NH4+-N比下TN去除效果。在批式實驗的基礎上，以最佳NO3−-N/NH4+-N比進行連續實驗，考察厭氧氨氧化菌和部分反硝化菌的活性變化。SBR的運行周期為130 min，其中，進水2 min，曝氣攪拌100 min，沉淀20 min，出水3 min，閑置5 min。
1.3 實驗廢水
實驗反應器采用人工配制的進水，組分組成：NH4Cl(以N計) 20~40 mg·L−1，NaNO3(以N計) 20~50 mg·L−1，乙酸鈉(以COD計) 60~120 mg·L−1，KHCO3 500 mg·L−1，KH2PO4 50 mg·L−1，CaCl2·2H2O 180 mg·L−1 ，MgSO4·7H2O 100 mg·L−1，微量元素Ⅰ、Ⅱ[14]各1 mL·L−1。
1.4 反應活性的測定方法
厭氧氨氧化反應、反硝化反應及厭氧氨氧化耦合部分反硝化反應的活性測定方法相同，具體操作步驟如下：反應周期結束時，從反應器中取200 mL顆粒污泥混合液，經無氧水淘洗后置于500 mL用錫箔紙包裹的廣口瓶中，依據測定的活性不同，加入相應的基質，然后用含微量元素的無氧水定容至400 mL，用橡膠塞塞緊后向瓶內通入高純氮氣(99.999%)以維持厭氧條件。反應pH由PBS緩沖溶液控制在7.5，定時取樣，分析測定樣品中的NH4+-N、NO3−-N、NO2−-N等指標。厭氧氨氧化反應活性測定時起始基質濃度為NH4+-N 30 mg·L−1，NO2−-N 40 mg·L−1，KHCO3 0.5 g·L−1;反硝化活性測定時起始基質濃度為NO3−-N 30 mg·L−1，COD 75 mg·L−1;厭氧氨氧化耦合部分反硝化反應活性測定時所加起始基質濃度為NH4+-N 30 mg·L−1，NO3−-N 36 mg·L−1，COD 90 mg·L−1。耦合反應中用氨氮的氧化速率和硝酸鹽的還原速率分別代表厭氧氨氧化菌與部分反硝化菌的活性。
1.5 分析方法
1.5.1 常規指標分析
各項指標均按文獻中的方法[15]進行測定：NH4+-N：納氏試劑分光光度法;NO2−-N：(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3−-N：紫外分光光度法;pH采用雷磁PHS-3C型pH計;MLSS和MLVSS采用重量法。
1.5.2 熒光原位雜交
接種的厭氧氨氧化顆粒污泥中的微生物菌群采用熒光原位雜交法進行分析，具體操作參照文獻中的方法[16]進行。顆粒污泥采用冷凍切片機(Leica CM 1950，Germany)進行切片，雜交后的樣品通過激光共聚焦顯微鏡(TCS SP8，萊卡)進行觀察，并在100倍的物鏡下采集圖像。實驗所用探針如表1所示，總細菌采用Eub338mix(為Eub338，Eub338Ⅱ及Eub338Ⅲ三者等體積混合)，厭氧氨氧化菌采用Amx368。厭氧氨氧化菌的定量是在每個污泥樣品共隨機采集 50 張圖像，經 Image-Pro Plus 軟件處理后，統計目標微生物占總生物量的比例。
表1 熒光原位雜交實驗中監測厭氧氨氧化菌所用探針
1.6 速率及轉化效率計算
部分反硝化過程的速率及亞硝氮積累率按式 (1)~(3)計算：
R H, NO 3 − −N =−dC NO 3 − −N dt X RH, NO3−-N=−dCNO3−−NdtX(1)
R S, NO 2 − −N =dC NO 2 − −N dt X RS, NO2−−N=dCNO2−−NdtX(2)
R J, NO 2 − −N =C tNO 2 − −N −C 0NO 2 − −N C 0NO 3 − −N −C tNO 3 − −N ×100% RJ, NO2−−N=CtNO2−−N−C0NO2−−NC0NO3−−N−CtNO3−−N×100%(3)
厭氧氨氧化過程的速率按式 (4)~(6)計算：
R O, NH 4 + −N =−dC NH 4 + −N dt X RO, NH4+−N=−dCNH4+−NdtX(4)
R H, NO 2 − −N =−dC NO 2 − −N dt X RH, NO2−-N=−dCNO2−−NdtX(5)
R S, NO 3 − −N =dC NO 3 − −N dt X RS, NO3−-N=dCNO3−−NdtX(6)
式中：R H, NO 3 − −N RH, NO3−-N 與R H, NO 2 − −N RH, NO2−-N 分別為NO3−-N與NO2−-N還原速率，mg·(g·h)−1;R O, NH 4 + −N RO, NH4+-N 為NH4+-N氧化速率，mg·(g·h)−1;R S, NO 2 − −N RS, NO2−-N 為NO2−-N生成速率，mg·(g·h)−1;R J, NO 2 − −N RJ, NO2−-N 為NO2−-N積累率，%;CNO3−-N與CNO2−-N分別為NO3−-N與NO2−-N濃度，mg·L−1;C0NOx−-N與CtNOx−-N分別為取樣起始與取樣t時刻NO2−-N或NO3−-N濃度，mg·L−1;X為污泥濃度，g·L−1，以VSS計。
2 結果與討論
2.1 厭氧氨氧化接種污泥種群結構
接種的厭氧氨氧化污泥熒光原位雜交照片如圖1所示。圖1中顯示紅色熒光信號(厭氧氨氧化菌)與綠色熒光信號(總細菌)的重合度較高，且顆粒污泥的熒光信號呈環形，外部熒光信號比內部強，這是因為受傳質阻力的影響，使得顆粒污泥外部基質濃度較高，顆粒內部基質不足而引起細胞自融所致。由局部放大圖(圖1(d))可見顆粒污泥微生物以微小的菌落群聚集分布，各群落間可能含有大量胞外聚合物，而胞外聚合物有利于污泥顆粒化。厭氧氨氧化菌的含量占總細菌含量的(90.39±4.76)%，說明接種污泥中厭氧氨氧化菌為優勢菌屬，接種該污泥有利于耦合實驗的進行。
圖1 接種厭氧氨氧化顆粒污泥FISH分析
2.2 耦合前部分反硝化與厭氧氨氧化污泥活性
圖2為部分反硝化污泥的反應活性測定結果。實驗結果顯示，隨著反應的進行，硝酸鹽濃度逐漸降低，同時亞硝酸鹽濃度逐漸增加。反應起始時測得NO3−-N與NO2−-N濃度分別為32.45 mg·L−1與0.68 mg·L−1，反應60 min時測得NO3−-N與NO2−-N濃度分別為0.81 mg·L−1與29.22 mg·L−1,反應過程中硝酸鹽的還原量與亞硝酸鹽的積累量大致相同,可實現亞硝酸鹽的穩定積累。由式 (1)~式 (3)計算可得硝酸鹽的還原速率為257.68 mg·(g·h)−1,亞硝酸鹽的積累速率為225.76 mg·(g·h)−1,亞硝氮的積累率高達90.19%。
圖2 部分反硝化反應過程中NO3−-N與NO2−-N濃度隨時間的變化.
圖3為厭氧氨氧化污泥的反應活性測定結果。反應過程中NH4+-N、NO2−-N的降解與NO3−-N的產生均為零級反應,線性關系良好。其中,ΔNO2−-N/ΔNH4+-N為1.36±0.11,ΔNO3−-N/ΔNH4+-N為0.25±0.04,比LOTTI等[20]報道的理論值(1.146)偏大。反應結束后測得MLVSS為2 067 mg·L−1，由式 (4)~式 (6)計算得氨氮與亞硝氮的降解速率分別為9.13 mg·(g·h)−1 和12.84 mg·(g·h)−1，硝氮的生成速率為3.02 mg·(g·h)−1。
由活性測定結果可知，部分反硝化過程中亞硝酸鹽的積累速率是厭氧氨氧化過程中亞硝酸鹽還原速率的17.58倍，為保證耦合過程中兩者的速率平衡，按此比例向反應器中接種厭氧氨氧化污泥與部分反硝化菌污泥量。具體聯系污水寶或參見http://m.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
圖3 厭氧氨氧化反應過程中NH4+-N、NO2−-N和NO3−-N濃度隨時間的變化
2.3 不同NO3−-N/NH4+-N比下耦合批式實驗結果
不同NO3−-N/NH4+-N比的批式實驗結果見圖4。當NO3−-N/NH4+-N比在0.8~1.6的范圍時，隨著反應的進行，NH4+-N和NO3−-N濃度均呈下降趨勢，表明反應器中厭氧氨氧化作用與反硝化作用同步進行，實現了兩者的耦合。
進水NO3−-N/NH4+-N比不同，各反應物的去除率也不相同。圖4(a)和圖4(b)是NO3−-N/NH4+-N比分別為0.8和1.0的情況。當NO3−-N被完全消耗后，尚有部分剩余NH4+-N存在，且比值越高，剩余越少。這是由于進水硝酸鹽量太少不能為厭氧氨氧化反應提供足夠的NO2−-N，使得厭氧氨氧化反應由于缺乏電子供體而終止。當NO3−-N/NH4+-N比值為1.2時(圖4(c))，反應過程中部分反硝化反應產生的NO2−-N剛好被厭氧氨氧化反應所利用，兩者協同脫氮。當NO3−-N/NH4+-N比值繼續增大為1.6時(圖4(d))，硝酸鹽經部分反硝化提供的NO2−-N已超過厭氧氨氧化反應所需數值，NH4+-N被完全消耗后，尚有部分剩余的硝酸鹽，此后，厭氧氨氧化反應終止，剩余的NO3−-N被繼續還原。由于水中無氨氮存在，阻礙了反硝化菌的合成，因此，相應的硝酸鹽利用速率也隨之下降，由6.83 mg·(g·h)−1降為1.89 mg·(g·h)−1。剩余NO3−-N一部分還原為NO2−-N，另一部分被完全反硝化還原為N2。雖然此時TN的去除率仍高達91.98%，但在該條件下長期運行，由于具有完全反硝化功能的異養菌增殖，將不利于耦合系統的穩定。
批式實驗結果表明，NO3−-N/NH4+-N的最佳比值為1.2，此時NH4+-N、NO3−-N及TN的去除率分別為92.85%、99.68%和96.42%。
圖4 不同進水NO3−-N/NH4+-N比下耦合反應中各氮素濃度變化
2.4 耦合系統的連續運行狀況
耦合系統連續運行20個周期, 進出水三氮變化及結果見圖5。在起始的2個周期進水NO3−-N/NH4+-N比較小，分別為0.96和0.99，以便反硝化菌和厭氧氨氧化菌逐漸適應培養環境;其后，進水NO3−-N/NH4+-N比值均控制在最佳范圍(1.1~1.3)。在實驗條件下，耦合系統在低濃度氨氮下獲得了穩定的脫氮效果。在進水NH4+-N濃度20~30 mg·L−1、NO3−-N濃度為25~35 mg·L−1時，出水NH4+-N濃度從12 mg·L−1逐漸降低到3 mg·L−1以下，NO3−-N與NO2−-N濃度均在1.5 mg·L−1以下，NH4+-N、NO3−-N和TN的平均去除率分別為86.5%、95.2%和94.88%。
圖5 部分反硝化厭氧氨氧化耦合反應器運行期間脫氮性能
圖5(c)為運行期間耦合系統中厭氧氨氧化反應與部分反硝化反應的活性變化情況。在耦合反應器運行過程中，厭氧氨氧化菌對氨氮的氧化速率基本恒定，維持在(4.62±0.44) mg·(g·h)−1;而部分反硝化菌對硝酸鹽的還原速率在呈逐漸增大的趨勢，由(4.04±0.43) mg·(g·h)−1增加到(5.51±0.30) mg·(g·h)−1，這是由于部分反硝化菌的增殖速率(Y=0.3) [21]相對厭氧氨氧化菌(Y=0.066±0.01)[22]較快，單位體積中的部分反硝化菌含量增高所致。
從耦合系統典型周期內各氮素變化的趨勢(圖5(d))也可以看出，隨著培養周期的增加，耦合系統中微生物降解氨氮的曲線斜率基本不變，而硝酸鹽還原的曲線斜率逐漸增大，這與耦合系統中2種不同的微生物的脫氮途徑(硝酸鹽經亞硝酸鹽由厭氧氨氧化菌轉化為氮氣和硝酸鹽經亞硝酸鹽由反硝化菌轉化為氮氣)有關，可以用參與耦合反應的ΔNO3−-N/ΔNH4+-N的比值來衡量。當NO3−-N通過部分反硝化全部還原為NO2−-N為氨氧化提供電子受體時，在不考慮細胞合成的條件下，ΔNO3−-N/ΔNH4+-N的比值與厭氧氨氧化的ΔNO2−-N/ΔNH4+-N的比值相同，即1.146;在考慮部分反硝化菌的合成時，由于部分反硝化菌的增殖會消耗部分氨氮，從而導致ΔNO3−-N/ΔNH4+-N的比值降低，由本實驗第2周期的結果可見，ΔNO3−-N/ΔNH4+-N的比值約為0.99，與KALYUZHNY等[23]的研究結果(0.97)相近。隨著培養時間的增加,參與耦合反應的ΔNO3−-N/ΔNH4+-N比值逐漸增大，并且穩定在1.15±0.21(第20周期)，出水中并未檢測到NO2−-N積累，說明超出的亞硝酸鹽被繼續還原為氮氣，經計算，該部分NO3−-N占進水NO3−-N的15.7%。YESHI等[24]在研究主流厭氧氨氧化工藝處理低濃度市政廢水時同樣發現異養反硝化與厭氧氨氧化共存，且通過反硝化去除的氮占進水總氮的20%。雖然在低氨氮濃度下厭氧氨氧化耦合部分反硝化過程中不能避免硝酸鹽/亞硝酸鹽會被繼續還原，但不同周期內耦合系統對氨氮的氧化速率基本維持不變，表明厭氧氨氧化菌活性并未受到完全反硝化反應的競爭而降低，而是表現為協同作用與反硝化菌共同脫氮。
3 結論
1)通過接種優勢菌群為Thauera (71.85%)的反硝化污泥與培養成熟的厭氧氨氧化污泥可實現部分反硝化與厭氧氨氧化耦合，在乙酸鈉做碳源的條件下可實現同步去除NH4+-N和NO3−-N，為低濃度氨氮廢水(城鎮污水)的高效脫氮提供了基礎。
2)在COD/NO3−-N比為2.5，進水NO3−-N/NH4+-N比在0.8~1.6的范圍內均可實現部分反硝化與厭氧氨氧化協同脫氮，TN的去除率分別為73.20%、87.89%、96.42%、91.98%，最佳的NO3−-N/NH4+-N比為1.2。
3)耦合系統內厭氧氨氧化菌與異養反硝化菌存在協同與競爭關系，進水NO3−-N的84.3%通過厭氧氨氧化途徑轉化為氮氣，剩余15.7%通過異養反硝化途徑轉化為氮氣。(來源：環境工程學報 作者：陳國燕)
