苯酚作為一種重要的化工原料,廣泛應(yīng)用于酚醛樹脂、煉油、焦碳、染料、紡織、殺蟲劑、農(nóng)藥和醫(yī)藥等的生產(chǎn)中,因此,它也是環(huán)境中常見的污染物,在相應(yīng)化工工業(yè)廢水中含有較高的濃度。相對于其他疏水性有機(jī)污染物,苯酚易溶于水,微生物處理方法是去除廢水中這類有機(jī)物很有前景的方法。目前文獻(xiàn)報(bào)道的、可耐高濃度苯酚的菌株有酵母菌(Yeast trichosporon)、假單胞菌(Pseudonomonas sp. )、根瘤菌(Rhizobia)、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) 等。研究表明,微生物可以通過羥化和羧化途徑啟動(dòng)苯酚降解,且可進(jìn)一步開環(huán)裂解生成開環(huán)下游產(chǎn)物。目前有關(guān)微生物降解苯酚的羥化酶及其基因研究較充分,而羧化酶基因的功能研究較少。從目前的文獻(xiàn)報(bào)道看,苯酚羧化途徑僅在厭氧條件下進(jìn)行 ;然而,我們實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得一株能快速降解苯酚的菌株—施氏假單胞菌N2,研究發(fā)現(xiàn)在好氧狀態(tài)下亦有羧化產(chǎn)物的生成。為了更充分研究該菌細(xì)胞中羧基裂解酶基因的功能,實(shí)驗(yàn)室前期從N2 菌株中調(diào)取2 個(gè)羧基裂解酶基因ubiX 和ubiD,并已成功構(gòu)建ubiX 和ubiD 單突變株N2ubiX - 菌和N2ubiD - 菌及其該雙基因缺失的雙突變株N2ubiX - ubiD - 菌。筆者研究了N2 菌及其突變株降解苯酚過程中對苯酚毒性的響應(yīng)特性、開環(huán)裂解特性以及4 株菌生成苯酚下游產(chǎn)物的差異性,并對不同羧化基因在降解苯酚過程中所產(chǎn)生的作用進(jìn)行了研究。

　　1　材料與方法

　　1. 1　實(shí)驗(yàn)材料

　　1. 1. 1　菌種來源

　　施氏假單胞菌N2,本實(shí)驗(yàn)室分離并鑒定;N2 的突變株N2ubiX - 、N2ubiD - 和N2ubiX - ubiD - ,陜西省微生物研究所提供。

　　1. 1. 2　培養(yǎng)基

　　2 g NH4 Cl,2 mL 微量元素 ,25 mL 磷酸鹽緩沖液 , pH 為7. 5,用蒸餾水定容至1 000 mL,121 ℃高壓水蒸氣滅菌30 min,備用。

　　LB 培養(yǎng)基:酵母粉5. 0 g·L - 1 ,蛋白胨10. 0 g·L - 1 ,NaCl 10. 0 g·L - 1 ,蒸餾水1 000 mL,調(diào)節(jié)pH 值為7. 3 ~ 7. 5,121 ℃ 滅菌30 min,待用。

　　1. 2　實(shí)驗(yàn)方法

　　1. 2. 1　種子液的制備

　　在無菌操作環(huán)境下,將N2、N2ubiX - 、N2ubiD - 和N2ubiX - ubiD - 4 種菌株接種于相應(yīng)的LB 培養(yǎng)基中,于31 ℃ ,150 r·min - 1 搖床好氧振蕩20 h,OD550 nm 達(dá)到1. 86 ± 0. 07,待用。

　　1. 2. 2　不同苯酚濃度對N2 菌及其突變株生長特性和開環(huán)裂解苯酚的影響實(shí)驗(yàn)

　　取100 mL 上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基,在無菌操作環(huán)境下加入苯酚水溶液,使苯酚初始濃度分別為100、400、1 000 mg·L - 1 ,并且分別在其中接入8% 的N2 及其突變菌的種子液。31 ℃ ,150 r·min - 1 搖床培養(yǎng),定點(diǎn)取樣測定其OD550 nm 和紫外光譜。

　　1. 2. 3　N2 及其突變株對苯酚的降解效率

　　按照1. 2. 2 中的方法,將定點(diǎn)所取樣品于4 ℃ ,12 000 r·min - 1 ,離心10 min,收集上清液,將上清液用0. 22 的水系膜過濾至高效液相色譜專用小瓶,備用。

　　1. 2. 4　粗酶液的制備

　　將1. 2. 2 中培養(yǎng)24 h 的菌液在4 ℃ 下,12 000 r·min - 1 離心10 min,收集菌體。用0. 05 mol·L - 1 ,pH為7. 0 的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體2 次,再用該磷酸鹽緩沖液懸浮菌體細(xì)胞。置于0 ℃ 的冰水浴中,用JY88-II 型超聲波細(xì)胞破碎儀間歇處理10 次,每次1 min,功率450 W。破碎后,在4 ℃ 下,12 000 r·min - 1離心20 min,上清液為粗酶液,備用。

　　1. 2. 5　苯酚降解中間產(chǎn)物的提取及其衍生方法

　　按照1. 2. 2 中的方法,利用N2 菌降解苯酚,24 h 后,12 000 r·min - 1 ,離心10 min,收集上清液。用6mol·L - 1 的鹽酸調(diào)至pH 約為2,用3 × 20 mL 乙酸乙酯萃取,合并有機(jī)相,用無水硫酸鈉干燥,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至0. 5 mL,加0. 1 mL N,O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺, 60 ℃ 水浴,30 min,備用。

　　1. 3　分析方法

　　1. 3. 1　菌體濃度的測定條件

　　菌體濃度的測定采用比濁法 ,使用722 型分光光度計(jì)在550 nm 時(shí)測定其OD 值。

　　1. 3. 2　高效液相色譜法測定條件

　　日本分光公司LC-2000 二級管矩陣紫外檢測器高效液相色譜系統(tǒng)。其色譜柱為ODS Hypersil 反相C18(25 cm × 4. 6 mm,5 μm 填料)高效液相色譜柱。所用儀器為由PU-2089 四元梯度泵,MD-2010 二極管陣列紫外可見檢測器組成,進(jìn)樣系統(tǒng)為帶有100 μL 定量環(huán)的自動(dòng)進(jìn)樣器組成的日本分光JASCO LC-2010系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)中所使用的流動(dòng)相甲醇和超純水都需經(jīng)超聲處理,其中流動(dòng)相的體積比為V(超純水) ∶ V(甲醇) = 55 ∶ 45,進(jìn)樣體積15 μL,流速1 mL·min - 1 。

　　式中:ht 表示t 時(shí)刻高效液相色譜苯酚的峰高;h0 表示初始高效液相色譜中苯酚的峰高。

　　1. 3. 3　紫外吸收曲線的測定條件

　　將培養(yǎng)液在4 ℃ ,12 000 r·min - 1 下離心10 min,取上清液,用DR5000 分光光度計(jì)在波長340 ~ 400nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外波長掃描。

　　1. 3. 4　鄰苯二酚1,2-雙加氧酶和鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的活性測定方法

　　采用分光光度法[13] ,總體積為10 mL,其中粗酶液2 mL,0. 05 mol·L - 1 ,pH 為7. 0 的磷酸鹽緩沖液6. 9 mL,40 mmol·L - 1 EDTA 1 mL,30 mmol·L - 1 鄰苯二酚0. 1 mL。投加鄰苯二酚后,立即在30 ℃ 水浴中反應(yīng),每5 min 取樣一次,用DR5000 分光光度計(jì)在波長240 ~ 300 nm 和340 ~ 410 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外波長掃描。260 nm 處光吸收隨時(shí)間的增加值能反映C12O 的活性,260 nm 處峰值的增加標(biāo)志產(chǎn)物順,順-己二烯二酸的積累。375 nm 處光吸收隨時(shí)間的增加值能反映C23O 的活性,375 nm 處每增加1. 2 個(gè)吸光值代表1 mmol 2-羥基黏糠酸半醛(2-HMS)的生成,酶活性大小以每mg 蛋白每分鐘生成的產(chǎn)物的量表示,單位為μmol·(mg·min) - 1 。

　　1. 3. 5　蛋白質(zhì)的測定

　　按Bradford 法 進(jìn)行測定。

　　1. 3. 6　GC-MS 測定條件

　　美國Finnigan 公司Trace MS 型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀, 色譜柱為DB-5(30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm)。GC參數(shù):載氣為99. 999% 的高純氦氣,載氣流量為1 mL·min - 1 ,恒流模式,不分流,進(jìn)樣體積為1 μL,進(jìn)樣口溫度為280 ℃ 。升溫程序:60 ℃ 保持1 min,以5 ℃ ·min - 1 升至200 ℃ (保持5 min),再以15 ℃ ·min - 1升至280 ℃ (保持5 min)。MS 參數(shù):EI + 轟擊源,電子能量為70 eV,離子源溫度200 ℃ ,連接桿溫度為250 ℃ ,掃描方式為全掃描,掃描范圍為m / z 30 ~ 450,掃描時(shí)間為8 ~ 28 min。

　　2　結(jié)果與分析

　　2. 1　施氏假單胞菌N2 及其羧基裂解酶基因突變株對苯酚毒性的響應(yīng)特性

　　按照1. 2. 2 和1. 2. 3 中的方法,研究4 株菌在液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對苯酚毒性的抵抗性能及對苯酚的降解效率,結(jié)果如圖1、圖2 所示。

　　圖1 中(a)、(b)、(c)、(d) 分別為苯酚濃度100、400、800 和1 000 mg·L - 1 體系。圖1(a) 表明,N2ubiX - 在苯酚濃度低于100 mg·L - 1 時(shí),其細(xì)胞生長速度較快,在生長24 ~ 28 h 范圍內(nèi)各菌細(xì)胞均達(dá)到最大生長量,OD550 nm 分別0. 574 和0. 452。在高濃度苯酚條件下,突變株N2ubiX - 仍對苯酚為碳源的生長環(huán)境表現(xiàn)出相對好的適應(yīng)性,如圖1 所示,生長初期(約12 h),突變株N2ubiX - 的生長明顯比其他菌株快,其OD550 nm 值平均可高出0. 08 ~ 0. 25。這說明ubiX 基因可能對菌株生長有抑制作用。同時(shí)從圖1 也可看出,濃度在400 mg·L - 1 以下,苯酚毒性對N2 菌及其突變株的生長不產(chǎn)生明顯的抑制作用。而在濃度達(dá)到800 mg·L - 1 及其以上,尤其是濃度超過1 000 mg·L - 1 時(shí),苯酚的毒性對4 菌株的生長均產(chǎn)生了明顯的影響作用。相比之下,野生菌對高濃度苯酚的毒性適應(yīng)能力更大,因此,N2 菌株中ubiX 和ubiD 基因在該菌體細(xì)胞適應(yīng)苯酚毒性時(shí),具有重要作用。從4 個(gè)苯酚濃度的生長結(jié)果看,當(dāng)苯酚濃度在100 mg·L - 1 時(shí),碳源濃度較低,細(xì)胞生長量較小,而800 mg·L - 1 以上苯酚濃度,毒性較大,4 株菌生長受到抑制,為了充分研究N2 菌株中ubiX 和ubiD 基因的作用,下面選擇400 mg·L - 1 苯酚濃度的降解體系。

　　圖2 為4 菌株對苯酚的降解率。由圖2 可知,野生菌對苯酚的去除率普遍高于3 株突變菌,說明ubiX和ubiD 基因在N2 菌降解苯酚中起一定的作用。對單突變菌株,在46 h 時(shí)2 株單突變菌的苯酚降解率之和等于野生菌在此時(shí)段對苯酚的降解率,而在后期,單突變菌對苯酚的降解率升高,說明菌株對苯酚體系存在較長時(shí)間的生長延緩期,之后就會(huì)迅速生長并降解苯酚。就雙突變菌株來講,苯酚濃度400 mg·L - 1時(shí)其對苯酚存在一定的去除率,說明雖然ubiX 和ubiD 基因在N2 菌降解苯酚中起一定的作用,但N2 菌中還存在其他影響苯酚降解的基因。

　　2. 2　ubiX 和ubiD 基因?qū)�N2 菌中開環(huán)裂解酶活性的影響作用

　　按照1. 2. 2 中的實(shí)驗(yàn)方法和1. 3. 3 中的分析方法,研究與2. 1 中實(shí)驗(yàn)平行培養(yǎng)的苯酚濃度為400mg·L - 1 反應(yīng)體系中2-HMS 的生成、積累及其進(jìn)一步代謝的特性。結(jié)果如圖3 所示,(a)、(b)、(c)、(d)分別為生長時(shí)間為12、24、36 和60 h 時(shí)所取樣,340 ~ 410 nm 范圍的吸收峰為鄰苯二酚間位開環(huán)裂解產(chǎn)物2-HMS 在375 nm 處的特征吸收峰。

　　由圖3 可知,4 株菌生長至12 h 時(shí),降解液在375 nm 處的吸收峰很小,即鄰苯二酚間位開環(huán)裂解產(chǎn)物2-HMS 的積累量很少。而當(dāng)生長至24 h 時(shí),降解液在375 nm 處吸收峰的峰值達(dá)到最大,即轉(zhuǎn)化產(chǎn)物2-HMS 的積累量達(dá)至最大值。由圖3(c)和圖3(d)可知,與24 h 相比,生長至36 h 和60 h 時(shí),375 nm 處的吸收峰峰高降低,說明前期積累的2-HMS 被進(jìn)一步分解為其他中間物質(zhì)。按照文獻(xiàn)報(bào)道,2-HMS 最終可轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酮酸等三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。生長至24 h 時(shí),N2 菌株的2-HMS 積累量最大,含量用吸光度A 表示為0. 928,而3 株突變菌中,最易間位開環(huán)裂解的為突變N2ubiX - ,其吸光度A 可達(dá)到0. 632,而N2ubiD - 菌與N2ubiX - ubiD - 菌在375 nm 處的吸光度A 相近,分別為0. 447 和0. 41;因此可以推測ubiX 基因不利于苯酚間位裂解。

　　鄰苯二酚裂解酶有2 種:其一是鄰苯二酚1,2-雙加氧酶(C12O),其催化作用使鄰苯二酚從鄰位開環(huán)裂解,生成順,順-己二烯二酸;其二是鄰苯二酚2,3-雙加氧酶(C23O),其催化作用則是鄰苯二酚從間位開環(huán)裂解,生成2-HMS。

　　根據(jù)上述的分析結(jié)果,選擇生長至24 h 時(shí)的降解液,按照1. 2. 4 中的實(shí)驗(yàn)方法、1. 3. 4 和1. 3. 5 中的分析方法,研究4 株菌對鄰苯二酚C12O 和鄰苯二酚C23O 的影響作用。

　　表1 為4 株菌降解苯酚過程中鄰苯二酚鄰/ 間位開環(huán)裂解時(shí)C12O 和C23O 酶在反應(yīng)10 min 時(shí)的比活力。該結(jié)果說明,4 株菌在以苯酚為唯一碳源時(shí),均能誘導(dǎo)產(chǎn)生C12O 和C23O。由表1 可知,反應(yīng)時(shí)間為10 min 時(shí),能誘導(dǎo)產(chǎn)生的C23O 酶活性最大的為N2 菌株,蛋白酶活可達(dá)0. 045 8 μmol·(mg·min) - 1 ,而突變株中酶活最大的為N2ubiX - 菌。而對于C12O,N2ubiX - ubiD - 的活性最大,分別為N2、N2ubiX - 和N2ubiD - 的1. 43、1. 28 和1. 67 倍。即可以認(rèn)為影響鄰苯二酚間位開環(huán)裂解的主要基因?yàn)閡biD,而影響鄰位開環(huán)裂解的基因?yàn)閡biX。

　　2. 3　最佳苯酚濃度下4 株菌降解苯酚產(chǎn)物的差異性

　　按照1. 2. 5 中的方法提取4 株菌降解苯酚的中間產(chǎn)物,用1. 3. 6 中的GC-MS 分析方法對代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離,得到N2、N2ubiX - 、N2ubiD - 與N2ubiX - ubiD - 菌株以苯酚生長24 h 中間產(chǎn)物GC-MS 圖。結(jié)果表明,4 株菌中降解苯酚得到的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有較大的差別。其中野生菌株N2 代謝苯酚可檢出12 種中間產(chǎn)物。

　　相同條件下,突變株N2ubiX - 代謝苯酚也可檢出12 種中間產(chǎn)物,但含量明顯低于野生菌降解苯酚的中間產(chǎn)物含量。而N2ubiD - 和N2ubiX - ubiD - 代謝苯酚時(shí)只能檢出6 種中間產(chǎn)物,積累的中間產(chǎn)物種類較少。

　　通過質(zhì)譜圖解析,將4 株菌均可產(chǎn)生的羧化和羥化途徑的3 種代表性產(chǎn)物的色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜碎片以及名稱等總結(jié)于表2 中。

表1　10 min 內(nèi)鄰苯二酚鄰/ 間位裂解酶比活力

表2　4 株菌代謝苯酚的中間產(chǎn)物的色譜性質(zhì)

　　作為苯酚鄰/ 間位開環(huán)裂解產(chǎn)物,順,順-己二烯二酸和2-HMS 的質(zhì)譜圖如圖4、圖5 所示。

　　由圖4 可知,此物質(zhì)的主要碎片離子峰主要有271,243,227,213,196,181,169,153,147,140,128,107,95,79,73,52,45,m / z = 271 為M + - 15(—CH3 ),m / z = 243 為M + - 45(—CH3 )3 + 2(H),m / z = 227為M + - 60(—CH3 )4 + 1(H),m / z = 213 為M + - 73[—Si(CH3 )3 ],m / z = 196 為M + - 89[—OSi(CH3 )3 ]- 1(H),m / z = 181 為M + - 89[—OSi(CH3 )3 ] - 15(—CH3 ) - 1(H),m / z = 169 為M + - 117[—COOSi(CH3 )3 ],m / z = 153 為M + - 117[—COOSi(CH3 )3 ] - 15(—CH3 ) - 1(H),m / z = 147 為[—Si(CH3 )3 ]2 ,m / z = 140 為M + - 146 [—Si(CH3 )3 ]2 ,m / z = 128 為M + - 117 [—COOSi(CH3 )3 ] - 26 ( CH ????CH) -15(—CH3 ),m / z = 107 為M + - 178[—OSi(CH3 )3 ] - 1(H),m / z = 95 為M + - 117[—COOSi(CH3 )3 ] -73[—Si(CH3 )3 ] - 1(H),m / z = 79 為M + - 117[—COOSi(CH3 )3 ] - 89[—OSi(CH3 )3 ] - 1(H),m / z = 73為—Si(CH3 )3 ],m / z = 52 為CH ????CHCH ????CH,m / z = 45 為(CH3 )3 ,綜上可以推測出此物質(zhì)為順,順-己二烯二酸。

　　由圖5 可知,該物質(zhì)的分子離子峰M + m / z = 286,主要的碎片離子峰有m / z = 271,257,243,197,187,169,157,147,128, 79, 75, 73, 55, 45。M + - 15 [ CH3 ] = 271, 說明斷下了[ CH3 ] 碎片。M + - 117[—COOSi(CH3 )3 ] = 169,說明存在被衍生的羧基。而147 的存在說明被衍生2 次,即該結(jié)構(gòu)中含有2 個(gè)羧基或1 個(gè)羧基和1 個(gè)羥基。M + - 257 = 29(CHO),M + - 68(OHCCH=CHCH) - 15[CH3 ] + 1[H] =204,M + - 68(OHCCH =CHCH) - 117[—COOSi(CH3 )3 ] = 89[O—Si(CH3 )3 ]。綜上可以推測出此物質(zhì)為2-HMS。具體參見污水寶商城資料或http://m.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3　結(jié)論

　　1)施氏假單胞菌N2 以唯一碳源苯酚生長時(shí),就生長特性來看,ubiD 基因作用大于ubiX 基因。從菌株對苯酚的降解率上看,野生菌對苯酚的降解效率均高于突變株,說明ubiD 和ubiX 等羧基裂解酶基因在苯酚降解過程中發(fā)揮重要作用。

　　2)施氏假單胞菌N2 以苯酚為唯一碳源生長時(shí),降解反應(yīng)期間,基因ubiD 主導(dǎo)的是鄰苯二酚間位開環(huán),而基因ubiX 主導(dǎo)的是鄰苯二酚鄰位開環(huán)。

　　3)從質(zhì)譜結(jié)果分析,野生菌和突變菌以苯酚為碳源生長時(shí),均能通過羥化和羧化開環(huán)裂解途徑將苯酚轉(zhuǎn)化成中間產(chǎn)物:順,順-己二烯二酸和2-HMS。其中,單突變株N2ubiX - 降解苯酚過程中生成的中間產(chǎn)物與野生菌相比,種類相等,但各中間產(chǎn)物含量明顯低于野生菌,而單突變株N2ubiD - 和雙突變菌株N2ubiX - ubiD - 代謝苯酚的中間產(chǎn)物的含量及種類都明顯低于野生菌。