由于冬季低溫的影響，中國北方污水處理廠常面臨季節(jié)性TN超標(biāo)的問題.此外，受制于市政污水低碳氮比的水質(zhì)特性，污水處理廠也面臨著異養(yǎng)反硝化不充分而導(dǎo)致的TN超標(biāo)問題.與異養(yǎng)反硝化相比，硫自養(yǎng)反硝化是以還原態(tài)硫?yàn)殡娮庸�體，NO3--N為電子受體進(jìn)行的自養(yǎng)反硝化過程，能夠有效地去除水中的NO3--N.硫自養(yǎng)反硝化因無需外加碳源、運(yùn)行成本低、污泥產(chǎn)量少、效率高、工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛關(guān)注.目前，Li等將硫自養(yǎng)反硝化工藝應(yīng)用于低溫、低碳氮比條件下污水處理廠氮污染物的去除，并達(dá)到了90%以上的氮去除效果.另一方面，硫自養(yǎng)反硝化過程作為冬季或低碳比條件下的脫氮保障工藝，常面臨季節(jié)性、間歇性運(yùn)行的操作方式.但是針對硫自養(yǎng)反硝化工藝饑餓忍耐后能力恢復(fù)及其對微生物菌群結(jié)構(gòu)影響的研究卻鮮見報(bào)道.

　　近年來，分子生物學(xué)作為有效手段用來研究污水處理過程中微生物群落結(jié)構(gòu)特性，如變形梯度凝膠電泳、克隆文庫和高通量測序等. MiSeq高通量測序以Illumina的測序技術(shù)為基礎(chǔ)，通過可逆終止試劑方法對數(shù)百萬個(gè)基因片段同時(shí)進(jìn)行大規(guī)模平行測序，具有分析結(jié)果精確、高速等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于污水處理過程中微生物結(jié)構(gòu)和多樣性研究.

　　本文以顆粒硫磺和黃鐵礦的硫自養(yǎng)反硝化反應(yīng)器為研究對象，探究反應(yīng)器在經(jīng)過30 d饑餓忍耐后的恢復(fù)情況，并利用MiSeq高通量測序?qū)︷囸I忍耐前后反應(yīng)器中細(xì)菌群落的變化情況進(jìn)行分析，以期為污水處理廠脫氮保障工藝的季節(jié)性、間歇性運(yùn)行提供技術(shù)參考.

　　1 材料與方法1.1 試驗(yàn)裝置

　　硫自養(yǎng)反硝化工藝采用降流式生物濾池，試驗(yàn)裝置示意圖如圖 1所示.反應(yīng)器為密封的有機(jī)玻璃柱，內(nèi)徑140 mm，高度1 170 mm，填充高度500 mm，有效容積5.94 L.進(jìn)水口距柱底600 mm，沿反應(yīng)器不同高度處分別設(shè)置取填料口，取填料口距填料頂部的距離分別是100 mm和300 mm.

圖 1 試驗(yàn)裝置示意

　　試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)反應(yīng)器(分別記為1號、2號)，1號反應(yīng)器加入硫磺和白云石的混合物，2號反應(yīng)器加入黃鐵礦和白云石的混合物. 2個(gè)反應(yīng)器中的填料均按1:1的體積比混合裝填，硫磺、黃鐵礦和白云石的粒徑均為5~10 mm.其中，硫磺/白云石的填充區(qū)域孔隙率為45.9%，黃鐵礦/白云石為44.1%.

　　1.2 進(jìn)水水質(zhì)和接種污泥

　　本試驗(yàn)用水為人工模擬污水廠尾水，水質(zhì)指標(biāo)為: NO3--N濃度為30 mg·L-1，NH4+-N濃度為2 mg·L-1，TP濃度為1 mg·L-1，COD濃度為18~23 mg·L-1，pH為6.8~7.2.接種污泥取自高碑店污水處理廠二沉池回流污泥.

　　1.3 反應(yīng)器運(yùn)行方式

　　反應(yīng)器在低溫下運(yùn)行85 d (1月2日至3月26日)，主要分為穩(wěn)定期、饑餓期和恢復(fù)期:穩(wěn)定期(1~30 d)，正常進(jìn)水，反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行，平均溫度為12℃;饑餓期(31~60 d)，停止進(jìn)水，反應(yīng)器處于饑餓狀態(tài)，平均溫度12.8℃;恢復(fù)期(61~85 d)，恢復(fù)進(jìn)水，反應(yīng)器進(jìn)入恢復(fù)期，平均溫度為14℃.饑餓期結(jié)束后及恢復(fù)期采集反應(yīng)器中的污泥樣品(1號饑餓期A1、恢復(fù)期A2;2號饑餓期B1、恢復(fù)期B2) 進(jìn)行MiSeq高通量測序分析，分析反應(yīng)器饑餓期及穩(wěn)定期細(xì)菌群落的變化情況.

　　1.4 測試指標(biāo)和方法1.4.1 水質(zhì)指標(biāo)的測定

　　反應(yīng)器運(yùn)行期間，定期采樣進(jìn)行水質(zhì)指標(biāo)的測定，檢測項(xiàng)目包括硝酸鹽氮(NO3--N)、亞硝氮(NO2--N)、總氮(TN)、總磷(TP) 等.其中NO3--N采用紫外分光光度法測定;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定;TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定;TP采用鉬酸鹽分光光度測定.試驗(yàn)所用分光光度計(jì)為HACH DR5000紫外可見分光光度計(jì).生物量采用脂磷法測定.

　　1.4.2 微生物多樣性的測定

　　DNA的提取與PCR的擴(kuò)增:為了探究系統(tǒng)的細(xì)菌群落，在反應(yīng)的饑餓期和恢復(fù)期進(jìn)行取樣.采用E. Z. N. A. Soil DNA試劑盒(美國Omega公司)，按照試劑盒說明書提供的操作步驟提取.提取的DNA用1%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測. PCR的擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S rRNA的V3-V4區(qū)，細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增引物采用通用引物(338F/806R).引物名稱和引物序列分別是338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) 和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT). PCR反應(yīng)體系: Forward primer (10 μmol·L-1)，2 μL;Reverse primer (10 μmol·L-1)，2 μL;dNTPs (2.5 mmol·L-1)，4 μL;10×PCR buffer，5 μL;Pyrobest DNA Polymerase (2.5 U·μL-1)，0.3 μL;補(bǔ)充ddH2O至50 μL.反應(yīng)程序:先95℃預(yù)熱5 min;然后進(jìn)行25個(gè)循環(huán)(95℃變形30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s)，最后72℃延伸10 min.用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司) 回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)Tris-HCl洗脫后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.根據(jù)電泳結(jié)果.將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM -ST (Promega公司) 進(jìn)行定量，按照每個(gè)樣品的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合.

　　MiSeq文庫構(gòu)建與測序:用高通量測序平臺Illumina MiSeq對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行MiSeq高通量測序.測序得到的PE reads根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)過濾掉低質(zhì)量的reads，區(qū)別樣品后進(jìn)行OUT聚類分析和物種分類學(xué)分析.

　　生物多樣性和分類學(xué)分析:首先將序列按照彼此的相似性歸為操作分類單元(OTU).按照97%相似性進(jìn)行OUT聚類，采用RDP classifier對97%相似水平的OUT代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析.利用MOTHUR軟件對樣品覆蓋率(coverage percentage)，ACE，Chao豐富指數(shù)以及Shannon多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算.同時(shí)為了保證分析的高可信度，根據(jù)SILVA106庫中的參考序列對OUT進(jìn)行種屬鑒定，種屬比對的可信度閾值設(shè)定為80%.

　　2 結(jié)果與討論2.1 反應(yīng)器運(yùn)行情況

　　穩(wěn)定期、饑餓期和恢復(fù)期的硫自養(yǎng)1號和2號反應(yīng)器進(jìn)出水水質(zhì)的變化情況如圖 2所示.進(jìn)水NO3--N、NO2--N、TN和TP平均濃度分別為30.00、0.01、35.88和1.00 mg·L-1.穩(wěn)定期，反應(yīng)器在低溫下(12℃) 運(yùn)行30 d后，1號反應(yīng)器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP濃度分別為1.78、0.03、2.87和0.91 mg·L-1，TN去除率為91.9%，1號反應(yīng)器具有較高的脫氮效果. 2號反應(yīng)器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP濃度分別為11.32、0.11、13.10和0.14 mg·L-1，TN和TP去除率分別為63.49%和86.41%. 2號反應(yīng)器具有同步脫氮除磷的效果.

圖 2 饑餓前后反應(yīng)器NO3--N、NO2--N、TN、TP的變化

　　反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行后，停止進(jìn)水，進(jìn)入饑餓期.經(jīng)過30 d的饑餓忍耐后，反應(yīng)器在低溫下(14℃) 恢復(fù)進(jìn)水，進(jìn)入恢復(fù)期.由圖 2可以看出，饑餓忍耐后，1號反應(yīng)器出水NO3--N增加到27.87 mg·L-1，2號反應(yīng)器出水NO3--N增加到26.56 mg·L-1.但隨著反應(yīng)器的恢復(fù)，出水NO3--N濃度逐漸降低，1號反應(yīng)器經(jīng)5 d的恢復(fù)(第65 d)，出水NO3--N和TN濃度分別為0.38 mg·L-1和2.37 mg·L-1，去除率分別為98.8%和93.6%;2號反應(yīng)器經(jīng)11 d的恢復(fù)(第71 d)，出水NO3--N和TN濃度分別為10.51 mg·L-1和12.91 mg·L-1，去除率為66.40%和65.57%.其次，在恢復(fù)期2個(gè)反應(yīng)器的出水NO2--N濃度均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，恢復(fù)初期均出現(xiàn)NO2--N的積累.由圖 2可知，1號反應(yīng)器恢復(fù)期第3 d (第63 d) 出水NO2--N濃度為2.17 mg·L-1;2號反應(yīng)器恢復(fù)期第5 d (第65 d)，出水NO2--N濃度為0.37 mg·L-1.隨著反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行，最終1號反應(yīng)器NO2--N濃度下降到0.1 mg·L-1以下，2號反應(yīng)器有0.1 mg·L-1 NO2--N的積累量.此外，饑餓忍耐未對2號反應(yīng)器TP的去除效果產(chǎn)生明顯的影響.原因如下，2號反應(yīng)器對磷的去除主要是通過黃鐵礦中的鐵與磷結(jié)合形成鐵磷沉淀物及鐵的氧化物和氫氧化物對磷有吸附作用，饑餓條件下并未明顯影響這一物理化學(xué)過程.結(jié)果表明，與1號反應(yīng)器相比，2號反應(yīng)器的恢復(fù)時(shí)間略長，但2個(gè)反應(yīng)器都能在低溫、短期內(nèi)恢復(fù)到正常處理效果.

　　饑餓期(第60 d) 及恢復(fù)期(第85 d) 反應(yīng)器不同高度處微生物量的變化如表 1所示.從中可知，1號和2號反應(yīng)器饑餓忍耐后不同高度處微生物量均低于恢復(fù)期.分析原因，主要是饑餓期間反應(yīng)器中部分微生物對饑餓環(huán)境的忍耐能力差，裂解死亡;部分細(xì)菌因營養(yǎng)物質(zhì)缺乏而進(jìn)入休眠狀態(tài)，不能進(jìn)行生長繁殖.反應(yīng)器恢復(fù)進(jìn)水后，生物膜的活性和生長可得到不同程度的恢復(fù)，使得微生物量有所增加，同時(shí)反硝化性能得以恢復(fù).

　　表 1 饑餓忍耐前后反應(yīng)器不同高度處生物量的變化/nmol·g

　　2.2 微生物多樣性的分析

　　利用MiSeq平臺對A1、A2、B1、B2這4個(gè)污泥樣品進(jìn)行高通量測序，分別獲得39 989、39 302、45 227、61 572條優(yōu)化序列.將優(yōu)化序列截齊后與SILVA106庫比對后進(jìn)行聚類，在97%的相似性下分別獲得3 188、3 412、1 734、1 976個(gè)OUTs.并且4個(gè)污泥樣品的覆蓋率(Good's coverage) 均在95%以上，表明本研究中構(gòu)建的序列庫可以覆蓋細(xì)菌群落的多樣性(見表 2).

　　表 2 樣品的物種豐富度和多樣性分析

　　Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)表示微生物群落結(jié)構(gòu)的變化.群落豐富度用Chao指數(shù)描述，其值越高表明群落物種的豐富度越高;Shannon指數(shù)可以反映樣品的多樣性程度，其值越高表明群落物種的多樣性越高. 表 2顯示，4個(gè)污泥樣品的Chao和Shannon指數(shù)均為A2>A1>B2>B1.結(jié)果表明，1號反應(yīng)器中的物種豐度和多樣性均高于2號反應(yīng)器.分析原因，主要是黃鐵礦/白云石反應(yīng)器(2號) 中所用硫源為黃鐵礦，其硫含量低于硫磺.這使得硫磺/白云石反應(yīng)器(1號) 中的硫自養(yǎng)反硝化菌群因得到充足基質(zhì)而更好的生長.即由于基質(zhì)含量的不同，黃鐵礦/白云石反應(yīng)器中的自養(yǎng)反硝化菌種的生長受到一定的限制.另一方面，經(jīng)過30 d的饑餓忍耐后，硫磺/白云石和黃鐵礦白云石2個(gè)反應(yīng)器中微生物豐富度和多樣性明顯低于恢復(fù)期.分析原因，主要是饑餓期部分微生物對饑餓環(huán)境的忍耐能力差，裂解死亡，部分細(xì)菌因營養(yǎng)物質(zhì)缺乏而進(jìn)入休眠狀態(tài);恢復(fù)期生物膜的活性和生長可得到不同程度的恢復(fù).這與上述反應(yīng)器中微生物量饑餓期低于恢復(fù)期的變化是一致的.

　　2.3 群落結(jié)構(gòu)分析

　　基于SILVA數(shù)據(jù)庫的分類信息，對饑餓期及恢復(fù)期污泥樣品的高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了門、綱、屬水平上的分類分析.門分類水平上，4個(gè)污泥樣品共檢測出39個(gè)類群，門水平上的大量類群(相對豐度大于1%) 如圖 3所示.從中可知，A1和A2樣品中Proteobacteria為優(yōu)勢菌群，豐度分別為89.70%和89.77%，其次為Bacteroidetes (5.88%和5.60%) 和Chlamydiae (1.21%和1.71%)，其他菌類比例相對較低(相對豐度小于1%). B1和B2樣品中Proteobacteria為優(yōu)勢菌群，比例分別為51.82%和55.42%.此外，Bacteroidetes、Chlamydiae、Chloroflexi、Actinobacteria、Acidobacteria、Chlorobi、Planctomycetes、Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes也是B1和B2樣品中主要的門類(相對豐度大于1%).結(jié)果表明，1號和2號反應(yīng)器在生物群落結(jié)構(gòu)和豐度上具有比較明顯的差異.兩組反應(yīng)器最主要的優(yōu)勢菌門雖均為Proteobacteria，但其相對豐度存在明顯的差異，且2號反應(yīng)器在門水平上的主要類群較為多樣.此外，每組反應(yīng)器饑餓期和穩(wěn)定期豐度變化不大.

圖 3 門水平上群落結(jié)構(gòu)

　　綱分類水平上，1號和2號反應(yīng)器中共檢測出68個(gè)類群，其中7個(gè)類群為主要的綱，如圖 4所示. A1和A2樣品中主要的綱類為β-Proteobacteria，豐度為73.42%和69.15%，且β-Proteobacteria中的一些細(xì)菌是與污泥反硝化相關(guān)的[20~22];其次為α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Sphinggobacteria、Chlamydiae (相對豐度大于1%). B1和B2樣品中主要的綱類為α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria.此外B1和B2污泥樣品中還含有的δ-Proteobacteria、Ignavibacteria、Chlorobia、Actinobacteria、Anaerolineae、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Phycisphaerae. 圖 4表明，不同樣品中類群結(jié)構(gòu)及豐度差異性較大，1號反應(yīng)器中β-Proteobacteria的相對豐度高于2號反應(yīng)器，2號反應(yīng)器中α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria的相對豐度則高于1號反應(yīng)器.

圖 4 綱水平上群落結(jié)構(gòu)

　　屬分類水平上，1號和2號反應(yīng)器大量類群如圖 5所示.在屬水平上，2個(gè)反應(yīng)器中共檢測出296個(gè)細(xì)菌類群.其中A1和A2樣品中主要屬類為Sulfobacillus、Variovorax以及Thiobacillus，其豐度分別35.67%、8.82%、19.54%(A1) 和31.98%、13.25%、11.86%(A2).其中，Sulfobacillus是噬酸且耐熱的硫化物礦石氧化菌，也是亞鐵離子氧化菌. Thiobacillus為革蘭氏陰性細(xì)菌，是目前被報(bào)道最多的用于還原NO3--N的硫氧化細(xì)菌，可用于硫自養(yǎng)反硝化處理市政污水和地下水中的NO3--N.此外，A1和A2樣品中的主要類群(相對豐度大于1%) 還包括Thermomonas、Ferruginibacter、Denitratisoma、Sulfurimonas、Rhizobium.

圖 5 屬水平上群落結(jié)構(gòu)

　　與A1和A2樣品相比，B1和B2樣品中的主要類群包括Sulfobacillus、Variovorax、Thiobacillus、Denitratisoma、Ferruginibacter、Neochlamydia、Woodsholea、Blastocatella、Bradyrhizobium、Sulfuritalea等菌屬.并且不同時(shí)期反應(yīng)器中某些菌屬的相對豐度有一定的差別，如B1和B2樣品中Sulfobacillus和Thiobacillus在饑餓期和恢復(fù)期的相對豐度分別為0.06%、4.88%(B1) 和3.89%、0.70%(B2)。具體參見污水寶商城資料或http://m.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3 結(jié)論

　　(1) 顆粒硫磺/白云石和黃鐵礦/白云石反應(yīng)器經(jīng)過30 d的饑餓期后，分別需要5 d和11 d就可使NO3--N去除率恢復(fù)饑餓前的水平，且恢復(fù)期初期均出現(xiàn)NO2--N的積累現(xiàn)象.兩個(gè)反應(yīng)器在短時(shí)間內(nèi)均能恢復(fù)穩(wěn)定運(yùn)行，在低溫條件仍能保持良好的脫氮效果.

　　(2) 高通量測序結(jié)果表明，黃鐵礦/白云石反應(yīng)器的細(xì)菌群落的豐度和多樣性低于硫磺/白云石反應(yīng)器.經(jīng)過30 d的饑餓忍耐后，兩個(gè)反應(yīng)器的細(xì)菌群落的豐度和多樣性均略低于恢復(fù)期.

　　(3) 微生物群落結(jié)構(gòu)的分析表明，顆粒硫磺/白云石和黃鐵礦/白云石硫自養(yǎng)反應(yīng)器的優(yōu)勢菌門均為Proteobacteria，主要的綱類均為β-Proteobacteria.顆粒硫磺/白云石反應(yīng)器中存在起主要反硝化作用的Thiobacillus.