盡管很多人都看好硫酸鹽還原厭氧氨氧化污水脫氮技術的前景，但對該反應也一直存在不同的看法。Wang等人在膨脹顆粒污泥床（EGSB）反應器中發現，隨著進水NH4+-N濃度由166~666mg/L（N/S=0.25~0.99）增至1000~2000mg/L（N/S=1.48~2.96），硫酸鹽去除率從64%提高至71%，同時還去除了71%的NH4+-N；然而，當提高NH4+-N濃度至3000mg/L（N/S>4.44）時，硫酸鹽去除率卻降至28%左右。楊世東等人在厭氧序批式反應器（ASBR）中發現，在保持硫酸鹽為100mg/L條件下，當N/S值從1.0增加到3.0時，氨氮的平均去除率從78.5%增加到94.4%，但繼續將N/S值提高至4.0時，氨氮的平均去除率卻降至69.2%�？梢�，在不同N/S值條件下，硫酸鹽還原厭氧氨氧化工藝對氨氮和硫酸鹽的去除效率是不同的。
對于承擔硫酸鹽還原厭氧氨氧化的功能菌，Liu等在厭氧氨氧化反應器中分離出一種細菌，認為在硫酸鹽還原厭氧氨氧化過程中Anammoxoglobussulfate細菌起著關鍵作用；Cai等人還分離出一株具有代謝氨氮和硫酸鹽功能的細菌；另外，還有研究者認為硫酸鹽還原厭氧氨氧化過程是多種細菌的代謝耦合共同完成的。而不管是Liu或Cai等人分離出的細菌，亦或是多種細菌代謝耦合，其均認為硫酸鹽還原厭氧氨氧化過程屬于微生物自養過程。對于自養過程而言，微生物除了攝取必需的含氮化合物和硫酸鹽外，無機碳源的攝取也是必不可少的，且無機碳源的量也必定會對該過程有較大的影響。
由于去除機理不明，硫酸鹽還原厭氧氨氧化工藝仍存在啟動難度大、無法有效維持等諸多問題，這些問題嚴重阻礙了硫酸鹽還原厭氧氨氧化工藝的推廣及應用。故而，探明硫酸鹽還原厭氧氨氧化工藝機理是當前的緊要問題。筆者通過改變一個成功啟動的具有同步脫除氨氮和硫酸鹽的上流式厭氧污泥床（UASB）反應器的進水N/S值與無機碳源濃度，分析了UASB反應器不同高度處發生的氮循環與硫循環，旨在探明UASB反應器中硫酸鹽還原厭氧氨氧化工藝機理。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置
實驗裝置如圖1所示，采用有機玻璃制成的UASB反應器，反應器由反應區和三相分離區組成，內徑為100mm，反應區高600mm，反應器的有效容積為4.71L，反應區外設置20mm厚的水浴保溫層，在保溫層外面包裹鋁箔紙以避免光照影響微生物活性。實驗期間，溫度控制在（34±1）℃，pH控制在7.9±0.3，水力停留時間（HRT）設為24h。反應器各個接口處涂抹凡士林進行密封。
1.2 接種污泥與實驗進水
實驗用接種污泥取自西安市某啤酒廠的厭氧顆粒污泥，利用低濃度的NH4Cl與Na2SO（4NH4+-N與SO42--S分別為25、30mg/L）進行3個月的培養。初始MLSS為88.25g/L，MLVSS為47.32g/L，MLVSS/MLSS=0.54。
實驗進水采用人工模擬廢水，進水中的NH4+與SO42-分別由NH4Cl與Na2SO4提供。配水組分如下：27mg/L的KH2PO4、500mg/L的NaHCO3、500mg/L的KHCO3、38mg/L的CaCl2、20mg/L的MgCl2·6H2O，NH4Cl與Na2SO4按需添加，具體見表1。
1.3 測定指標及方法
1.3.1 常規指標
常規指標的測試方法參考《水和廢水監測分析方法》（第4版）。NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測定；NO2--N、NO3--N及SO42--S均采用離子色譜法測定；S2-采用亞甲基藍分光光度法測定；H2O2采用硫酸鈦分光光度法測定；TOC采用TOC測定儀測定；pH采用PHS-3S型pH計測定；氧化還原電位（ORP）采用ORP儀測定；DO采用MO128-2M型便攜式溶解氧儀測定；污泥中的微生物采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察；元素分析采用場發射掃描電子顯微鏡（FESEM）進行。單質硫濃度根據以下公式進行計算：
1.3.2 批次實驗方法及運行條件
氨氧化（AOB）活性測定：從反應器污泥底部取5mL泥水混合物，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次并離心（4000r/min），置于100mL的血清瓶中，加入NH4+-N濃度為50mg/L的模擬廢水至100mL處，在34℃條件下曝氣以提供飽和溶解氧，每隔2h取樣一次，通過分析NH4+-N、NO2--N和NO3--N濃度的變化計算AOB活性。
厭氧氨氧化（AAOB）活性測定：從反應器污泥底部取5mL泥水混合物，用PBS沖洗3次并離心（4000r/min），置于100mL血清瓶中，加入NH4+-N和NO2--N濃度分別為50和70mg/L的模擬廢水至100mL處，利用氬氣對血清瓶進行除氧10min，將其密封后放入恒溫振蕩器（150r/min，34℃）進行反應，間隔6h取一次樣，通過分析NH4+-N、NO2--N和NO3--N濃度的變化計算AAOB活性。
批次實驗1：在COD分別為100、200、300mg/L條件下檢測硫酸鹽還原菌（SRB）活性，主要基質為Na2SO4和COD，其余基質與反應器進水相同，配制COD時均采用乙酸鈉作為碳源。從反應器底部取5mL泥水混合物，用PBS沖洗3次并離心（4000r/min），置于100mL血清瓶中，加入130mg/L的SO42--S及不同濃度的COD，用氬氣對血清瓶進行除氧10min，將其密封后放入恒溫振蕩器（150r/min，34℃）進行反應。分別在0、4、8、12與24h取樣檢測，通過分析SO42--S濃度的變化計算SRB活性。
批次實驗2：檢測反應器中的硫自養反硝化（SAD）現象，主要基質為硫粉及NO2--N和NO3--N。從反應器底部取5mL泥水混合物，用PBS沖洗3次并離心（4000r/min），置于100mL血清瓶中，加入32mg/L硫粉以及14mg/L的NO2--N及NO3--N，利用氬氣對血清瓶進行除氧10min，將其密封后放入恒溫振蕩器（150r/min，34℃）進行反應。分別在0、4、8、16與24h取樣檢測，通過分析SO42--S以及NO3--N濃度的變化計算SAD活性。
為提高實驗的準確性，批次實驗均設置3組平行樣，采用注射氬氣進血清瓶以保證瓶內的厭氧環境，每次取樣體積保持相同。所取樣品經0.22μm的濾頭過濾后再測定相應指標。
1.3.3 微生物菌群分析
污泥微生物群落結構分析采用基于IlluminaMiSeq測序平臺的細菌16SrDNA高通量測序技術。測序流程包括以OMEGA試劑盒E.Z.N.A™MagBindSoilDNAKit提取試劑盒進行微生物總DNA提取、聚合酶鏈式反應擴增、擴增產物回收純化、擴增產物熒光定量、MiSeq文庫構建和MiSeq測序。其中，PCR擴增采用的引物為MiSeq測序平臺的16SV3-V4通用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTA ATCC-3′）。以上工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
2、結果與分析
2.1 不同N/S值下NH4+-N與SO42--S的脫除效果
UASB反應器中NH4+-N、SO42--S、pH及S2-濃度的變化如圖2所示。在階段Ⅰ，N/S值保持在1.54，NH4+-N的平均脫除量為3.66mg/L，SO42--S的平均脫除量達到6.64mg/L，運行初期即觀察到NH4+-N和SO42--S發生了脫除現象。在階段Ⅱ提高SO42--S濃度后，N/S值達到了0.95，與階段Ⅰ相比，NH4+-N脫除量明顯增加，由3.66mg/L提高至11.02mg/L，SO42--S脫除量則略微降低，平均為5.44mg/L。
在階段Ⅲ和Ⅳ，提高NH4+-N濃度，進一步提高N/S值后，NH4+-N平均脫除量由11.02mg/L提高至23.86mg/L，而SO42--S平均脫除量則逐漸降至2.53mg/L。在階段Ⅴ，降低SO42--S濃度，避免反應器中S2-進一步積累，此時NH4+-N平均脫除量達到26mg/L，而SO42--S平均脫除量進一步降至1.25mg/L。提高NH4+-N濃度至100mg/L后進入階段Ⅵ，NH4+-N脫除量逐漸升高，平均脫除量達到了26.78mg/L，而SO42--S在運行末期基本不發生轉化。
接種污泥經過3個月的馴化，在經過短暫適應期后NH4+-N與SO42--S均發生脫除現象，出現硫酸鹽型厭氧氨氧化現象。從圖2可以看出，當調整進水N/S值時，NH4+-N與SO42--S脫除量并未受到明顯影響。在反應器運行期間，NH4+-N脫除量呈緩慢上升的趨勢，而SO42--S的脫除量波動較大且呈不斷下降趨勢。在實驗后期檢測不到SO42--S的脫除，可能是由于污泥衰亡產生SO42-以及發生的硫自養反硝化反應，形成了硫的再循環。反應器前期出水S2-濃度較高、波動較大，之后S2-濃度逐漸穩定在1.45mg/L左右。由于在反應器中未檢測到其他含硫物質，通過物料衡算得出至少存在35.06mg/L含硫物質積累于反應器中。
實驗初期即觀察到NH4+-N和SO42--S發生了脫除現象，但這一現象并不穩定。NH4+-N脫除量逐漸升高，SO42--S脫除量卻逐漸降低。進水中存在的飽和溶解氧僅為8mg/L，按照硝化反應來計算不足以氧化等量的NH4+-N，但是NH4+-N仍有較高的脫除量，Zhang等人認為HCO3-有可能作為電子受體參與了N和S之間的反應，因此本研究考察了不同濃度的HCO3-對NH4+-N和SO42--S轉化的影響。
2.2 HCO3-對NH4+-N和SO42--S轉化的影響
本實驗中添加NaHCO3以及KHCO3作為無機碳源維持反應器pH穩定，在連續流反應器持續運行至第162天時，NH4+-N、SO42--S及HCO3-濃度保持在100、60、305mg/L。如圖3所示，分別在第187天、第209天和第237天提高HCO3-濃度至668、835、1002mg/L，發現NH4+-N脫除量逐漸上升，SO42-脫除量則未受到影響，在本實驗中HCO3-并未參與到N和S的反應中。而反應器在第89天時通過批次實驗也檢測到3.4mgNH4+-N/gVSS的Anammox活性，即存在少量的Anammox菌。Anammox菌可通過厭氧氨氧化途徑將氨氮轉化后的少量NO2-作為電子受體，將氨氮氧化為N2，進一步提高氨氮的脫除量。
當HCO3-濃度提升至1002mg/L時，NH4+-N轉化量趨于穩定。分析原因，一方面可能是反應器底部的Anammox菌較少，利用HCO3-的能力已達到飽和；另一方面可能是前期能夠利用HCO3-的兼性自養微生物較少，導致HCO3-不能得到有效利用。對在反應器底部發現的黃色物質進行XRD檢測，發現在轉角為29.3°、35.9°、39.4°與43.1°處均有吸收峰，表明該物質主要為CaCO3。HCO3-大量積聚在反應器中，與進水中的Ca2+、Mg2+生成CaCO3及MgCO3等沉淀附著于顆粒污泥表面，不僅影響傳質效率，還會加速顆粒污泥解體，進而影響出水水質。
此外，由于UASB反應器的特點，在長期運行過程中污泥層菌群在反應器內呈垂直分布，可能出現各污泥層生化反應相耦合，導致NH4+-N及SO42--S的脫除，而在本實驗中NH4+-N與SO42--S的變化趨勢也表明有其他電子受體及其他生化反應參與了NH4+-N和SO42--S的轉化，因此檢測不同高度出水水質，以探究可能的轉化途徑。
2.3 不同高度處NH4+-N與SO42-的轉化情況
同一時刻在不同高度處采集水樣進行檢測，結果如圖4所示。進水NH4+-N在反應器底部即被脫除，由100.34mg/L降至73.23mg/L。此外，部分厭氧顆粒污泥上浮裂解，細菌死亡，導致出水口處的NH4+-N濃度上升，這也與體系內檢測到的ORP及TOC濃度變化一致。
TOC及SO42--S濃度呈先上升后下降的趨勢，SO42--S濃度先由135.16mg/L逐漸升至170.16mg/L，然后逐漸下降，在出水口處達到最低濃度135.08mg/L，由此觀察到出水SO42--S未能脫除。在中部污泥層TOC濃度高達20.12mg/L，SRB菌利用大量有機物及SO42--S進行異養硫酸鹽還原產生S2-，S2-濃度最高可達13.61mg/L。
由于進水中含有少量溶解氧，反應器底部發生了硝化作用使得NH4+-N濃度降低，而底部厭氧污泥死亡使TOC及SO42--S濃度逐漸升高。同時，厭氧污泥死亡時會釋放H2O2及·OH等氧化性物質而氧化NH4+-N，導致NH4+-N在厭氧污泥層被脫除。硫自養反硝化反應與硝化反應相耦合，S0或S2-被重新氧化為SO42--S，在反應器中上層SRB菌利用SO42--S及TOC發生硫酸鹽還原反應。綜上所述，認為實驗期間NH4+-N與SO42--S在不同位置分別被脫除。
2.4 反應器中N與S共同參與的反應
反應器底部NH4+-N由于硝化作用被氧化為NOx--N的同時，還存在硫酸鹽還原的產物S2-及S0。在S0及NOx--N都存在的情況下，硫自養反硝化細菌逐漸被富集而發生反應，反應方程式如下：
批次實驗2中分別添加S0以及NO2--N和NO3--N來證明反應器內發生的硫自養反硝化反應，對照組中僅放入與實驗組等量未添加任何基質的污泥，空白組僅添加基質溶液，實驗結果如圖5所示。、
在厭氧條件下對照組中的微好氧菌死亡導致SO42--S濃度升高，實驗組中NO2--N和NO3--N濃度下降，SO42--S濃度不斷上升且遠遠高于對照組，說明反應器中可發生硫自養反硝化反應，而S0的再氧化很可能是后期SO42--S不發生脫除的原因之一。因此認為，污泥中的微生物可利用NOx--N與S0實現N元素與S元素在反應器中的協同循環。
2.5 反應器中的硫酸鹽還原反應及其產物
運行初期SO42--S脫除量較高，之后逐漸降低，到后期SO42--S甚至不發生脫除。接種污泥濃度較高，MLVSS可達47.32g/L，在運行期間不斷衰亡釋放有機物。隨著反應器的不斷運行，污泥衰亡量逐漸降低，其釋放的TOC濃度呈下降趨勢，而SRB極有可能利用污泥衰亡釋放的TOC進行異養硫酸鹽還原，因此在厭氧環境下利用不同COD濃度進行批次實驗以檢測硫酸鹽還原活性。
批次實驗1中SO42--S濃度及ORP變化見圖6。
由圖6可知，1h內SO42--S濃度均有不同程度的上升，原因可能是污泥中含有的微好氧菌死亡釋放了部分SO42--S及有機物，而ORP則由于微生物死亡釋放有機物而短暫下降。之后SRB菌利用有機物進行異養硫酸鹽還原產生S2-，SO42--S濃度不斷降低，ORP在COD被消耗后緩慢回升。在COD為300mg/L的條件下，測得硫酸鹽還原活性最高，為9.91mgSO42--S/（gVSS·d）。
同時對反應器上層發現的部分黃色物質進行XRD檢測，發現在轉角為23.1°、25.9°、26.7°、27.7°及28.7°處均有吸收峰，顯示有S0生成。由于S2-為耗氧型污染物，易被氧化物質氧化，而反應器上層由于漏氧、水封條件差或顆粒污泥上浮裂解釋放氧化物質等因素，使得S2-逐漸被氧化為S0。
自來水以及污泥中所含Fe、Cu等金屬元素容易與SRB還原生成的S2-結合生成含硫礦物，形成以金屬或非金屬物質作為晶核的沉淀，為此對底部黃色污泥進行SEM觀察（如圖7所示），同時對反應器底部及中部初期和后期污泥進行元素分析，結果見表2。從圖7和表2可以看出，污泥中存在含硫沉淀形成的結晶物，且由于反應器內形成了CaCO3沉淀，反應器底部與中部污泥的Ca元素占比均明顯提高。與初期相比，后期反應器底部污泥中的S元素占比較低，可能是由于發生硫自養反硝化導致S0重新生成了SO42--S。中部污泥的S元素則開始積累，S元素占比由初始的1.1%積累至2.3%，說明發生硫酸鹽還原反應生成了S2-，之后被氧化為S單質積累在污泥層中，這也與2.3節的結果一致。
2.6 反應器中的氮和硫循環
反應器底部污泥負責NH4+-N的轉化。一方面，實驗初期接種的厭氧顆粒污泥中混有少量有機物，經過厭氧發酵后產生多種代謝產物，使異養菌大量增值同化NH4+-N，導致在厭氧環境下NH4+-N濃度降低；另一方面，由于進水桶未進行除氧，進水中攜帶少量的溶解氧（約8mg/L），當反應器底部兼性厭氧菌受到O2刺激時會產生H2O2，在反應器底部、中部及上部測得H2O2濃度分別為1.4、2.3、3.1mg/L，H2O2可氧化NH4+-N，提高NH4+-N的脫除量。而反應器內SO42--S的轉化則主要利用體系內污泥死亡釋放的TOC進行SO42--S還原。
當運行至第89天時，底部污泥逐漸由黑色轉變為黃色，經批次實驗證明底部污泥的硝化能力可達到30.25mgNH4+-N/（gVSS·d），且高通量測序同樣表明，底部污泥中存在硝化菌。硝化菌利用少量溶解氧將NH4+-N轉化為NO2--N，不僅為Anammox菌生長提供了所需的NO2--N，而且為Anammox菌增殖創造了條件。由于反硝化菌初始豐度比Anammox菌要高，對NO2--N的競爭力較強，初期Anammox菌的豐度較低，沒有合適的底物可供利用，生長較為緩慢，導致NH4+-N脫除量較低。反應器經過長時間運行后，硝化活性逐漸增強，硝化菌以及H2O2等使得NH4+-N脫除量提高，提供更多的NO2--N從而促進Anammox菌的生長。第89天利用批次實驗檢測到反應器底部的Anammox活性為3.4mgNH4+-N/（gVSS·d），Anammox反應參與底部NH4+-N的轉化，進一步提高了NH4+-N的脫除量。
在反應器運行至第150天時，SO42--S不發生脫除則是由于進水溶解氧使得厭氧污泥死亡，釋放了額外的SO42--S。此外，由于污泥攜帶的有機物被消耗，SRB僅利用污泥衰亡產生的TOC進行SO42--S還原，SO42--S還原量逐漸減少。同時，在反應器底部發生的硫自養反硝化反應以及中部的硫氧化反應，也使得S2-或S0重新生成SO42--S，最終使得出水SO42--S基本不發生轉化。
因此推斷，在反應器下層發生的是Anammox、硝化及硫自養反硝化耦合的生化反應，在中層與上層則發生的是硫酸鹽還原及硫氧化反應，見圖8。
2.7 微生物菌群解析
利用高通量技術分析了反應器在0、89、240d時污泥的微生物菌群結構，結果見圖9。可知，在反應器的3個運行階段，硝化菌、反硝化菌、硫酸鹽還原菌、硫自養反硝化菌以及硫氧化菌均存在。
在反應器底部檢測到Acinetobacter，其豐度由初始的0.023%增至第240天的25.22%，同時檢測到Comamonadaceae、Pseudoxanthomonas、Thiobacillus、Thermomonas等反硝化菌，初始總豐度僅為0.5%，在第89天提高至6.51%。其中，Thiobacillus是一種硫自養反硝化菌，其豐度由初始的0逐漸提高至1.32%，說明反應器中確實存在硫自養反硝化反應，這與2.5節的結果相吻合。高通量測序中并未發現Anammox菌，但在反應器運行至第89天時利用批次實驗檢測到較低的Anammox活性。反應器中Desulfomonile、Desulfovibrio及Syntrophobacteraceae等SRB菌，在初始接種污泥中的總豐度可達到4.96%，隨著反應器內有機物的減少，SRB菌的總豐度呈下降趨勢，在第240天下降至1.67%，這也與反應器中硫酸鹽脫除量降低的趨勢相吻合。同時，在反應器中存在少量的硫氧化菌屬，例如Rhodopseudomonas、Rhodobacteraceae等，可利用H2S進行代謝自養生長，總豐度可達到0.188%。
在第162天提高HCO3-濃度以后，NH4+-N脫除量增加。在主要負責脫氮的底部污泥中，檢測到Acinetobacter菌的豐度提高至78.87%。有研究者發現，Acinetobacter菌具有硝化及反硝化能力，甚至部分Acinetobacter菌群可進行異養硝化脫氮。底部污泥衰亡產生的少量有機物為Acinetobacter菌群異養硝化提供了基質，同時進水中少量的DO以及H2O2為Acinetobacter的好氧反硝化提供了條件，導致其大量增殖，反應器中氨氮的脫除主要發生在底部污泥中，而其與混合污泥菌群的差別僅在于Acinetobacter的豐度。即Acinetobacter的豐度決定了反應器的脫氮效果，因此認為Acinetobacter在反應器中起主要的脫氮作用。Desulfomonile、Desulfovibrio及Syntrophobacteraceae則是反應器中主要的SRB菌，利用SO42-作為電子受體進行SO42-還原反應。Thiobacillus作為反應中的硫自養反硝化細菌，可將SO42-還原生成的S2-或S0以NOx--N為電子受體氧化為SO42-，與硫氧化菌共同形成硫的再循環，其豐度逐漸提高使得SO42-的脫除量進一步降低，這也與2.1節中的推測相吻合。在本實驗中并未發現Cai等人鑒定出的可以同時利用NH4+-N以及SO42--S的BacillusBenzoevorans菌株，也未曾發現Liu等人在Anammox反應器中分離得到的脫氮除硫功能菌種Anammoxoglobussulfate。
因此，在本研究的反應器中，硝化、Anammox、異養反硝化及硫自養反硝化共同構成了系統內的氮循環；硫酸鹽還原、硫自養反硝化及硫好氧氧化共同構成了系統內的硫循環，氮、硫循環耦合使得反應器中出現硫酸鹽還原厭氧氨氧化。
3、結論
①改變UASB反應器進水N/S值時，NH4+-N與SO42--S的脫除量并未受到明顯影響。體系內存在的Anammox反應、兼性厭氧微生物產生的H2O2以及提高HCO3-濃度均有助于NH4+-N脫除量的提高。在將HCO3-濃度提高至1002mg/L后，NH4+-N脫除量不再升高。
②由于UASB反應器的特點，在不同高度污泥層形成了不同種類的微生物菌群，NH4+-N和SO42--S在不同位置分別被脫除，由不同層的氮、硫生化反應相互耦合形成硫酸鹽型厭氧氨氧化現象。
③溶解氧使得厭氧污泥死亡產生額外的SO42--S，SO42--S還原生成的S2-被Rhodopseudomonas、Rhodobacteraceae等硫氧化菌以及硫自養反硝化菌重新氧化為SO42--S，在反應器內部形成硫循環，導致出水SO42--S不發生脫除。而Acinetobacter主要負責反應器內NH4+-N的脫除，與Anammox、異養反硝化及硫自養反硝化共同構成體系內的氮循環。（來源：西安建筑科技大學環境與市政工程學院，陜西省環境工程重點實驗室，西北水資源與環境生態教育部重點實驗室）
