蚯蚓生物濾池集過濾吸附、好氧分解和污泥減量處理等功能于一體，已在多個國家得到研究和實踐。蚯蚓生物濾池作為一種生態型污水污泥同步處理技術，常用于農村地區的分散式污水污泥處理，是一種綠色友好型技術。病原菌的去除是剩余污泥農用的重要環節，隨著蚯蚓生物濾池相關研究的深入，關于其對剩余污泥病原菌去除的研究逐漸展開。通過靜態試驗發現，蚯蚓生物濾池生物膜中分離純化培養出的多個菌株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和克雷伯氏菌等典型病原菌表現出抑制作用，說明蚯蚓生物濾池對污水和剩余污泥中病原菌及指示菌的豐度具有削減作用，且可能與其生物膜微生物的拮抗作用有關。另外，蚯蚓體腔液含有大量免疫細胞及其分泌的活性分子，相關研究表明，蚯蚓體腔液中含有抗菌成分，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑制效果；另有研究表明，蚯蚓的勻漿上清液對豬場中分離的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌及副豬嗜血桿菌都有抑制效果；而蚯蚓脂肪及脂肪酸在抑菌和抗菌物理屏障中也發揮了相應作用，但二者在濾池中適應環境、抵抗微生物入侵發揮的作用仍未知，蚯蚓生物濾池中蚯蚓體腔液蛋白表達是否不同于其他環境也缺少相關探索。筆者借助GC/MS分析和蛋白組學等技術手段，借鑒免疫生態學領域相關概念和研究思路，分析蚯蚓生物濾池中活性物質對典型病原菌去除的影響，以期為利用蚯蚓生物濾池安全處置剩余污泥提供理論支撐。
1、材料與方法
1.1 試驗裝置與材料
試驗用污泥為上海市曲陽污水廠二沉池污泥，其含水率為99.3%~99.6%，pH為6.8~7.3，TCOD為4200~9000mg/L，SS為4000~7500mg/L，VSS/SS為52.1%~82.9%。試驗裝置為蚯蚓生物濾池（VF），如圖1所示。試驗蚯蚓采用赤子愛勝蚓，VF中添加個體質量在0.3~0.5g范圍內的健康成年蚯蚓，蚯蚓投加密度為32g/L濾料。在蚯蚓生物濾池四層結構各層中部取蚯蚓樣品混合后用于后續試驗，并另外挑選體質量為0.3~0.5g牛糞養殖的健康成年蚯蚓作為對照。
1.2 試驗設計
采用式（1）計算濾池對剩余污泥中典型病原菌的絕對去除率（RE）。
式中：VSSinf、VSSeff分別為進、出泥中的揮發性懸浮固體含量，mg/L；Abundinf、Abundeff分別為進、出泥中病原菌的相對豐度，%。
提取蚯蚓體腔液和組織脂肪，并對體腔液進行粗蛋白組分分離。使用超濾膜切割分子質量分別為3、10和30ku的Millipore超濾離心管，將體腔液中的蛋白分為0~3、3~10、10~30、>30ku四個分子質量范圍的粗蛋白。對于提取后的活性物質，通過微量稀釋法測定其抑菌效果。
針對試驗結果采用GraphPadPrismv8.0軟件進行統計學分析，檢驗其統計學差異性；并采用GC/MS對提取的濾池蚯蚓和對照蚯蚓粗脂質進行脂肪酸組分分析；同時對濾池蚯蚓及對照蚯蚓體腔液進行iTRAQ蛋白質組定量并進行差異蛋白分析。
1.3 活性物質抑菌能力測定方法的構建
沙門氏菌、大腸桿菌與金黃色葡萄球菌均為VF去除效果較顯著的菌種，以剩余污泥沙門氏菌與沙門氏菌標準菌株作為對比，可以分析剩余污泥及濾池環境對沙門氏菌抑制能力的影響；以大腸桿菌標準菌株作為常見指示菌，金黃色葡萄球菌標準菌株作為典型革蘭氏陽性致病菌與前述革蘭氏陰性菌作對照；因此選取剩余污泥內分離純培養的沙門氏菌、沙門氏菌標準菌株（ATCC14028）、大腸桿菌標準菌株（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌標準菌株（ATCC25923）作為試驗菌株。為方便記述，剩余污泥沙門氏菌記為sludgeSal.、沙門氏菌標準菌株記為stdSal.、大腸桿菌標準菌株記為stdEco.、金黃色葡萄球菌標準菌株記為stdSau.。
由于蚯蚓數量限制，根據美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）的說明，選用硫酸慶大霉素作為標準品，通過測定標準品的最小抑菌濃度（MIC）以及標準品二倍梯度稀釋液對應的96孔板抑菌培養前后吸光度（OD）擬合標準曲線，將一倍濃度體腔液及粗蛋白溶液在抑菌反應前后對應的96孔板OD值代入標準曲線，把蚯蚓活性物質抑菌能力折算為同等抑菌強度硫酸慶大霉素濃度進行互相比較。
硫酸慶大霉素對sludgeSal.、stdSal.、stdEco.、stdSau.的MIC分別為2.0、1.0、2.0、0.5μg/mL，表明不同種類病原菌或指示菌對同劑量的同種抑菌藥物的抗性有所不同，其中stdSau.對硫酸慶大霉素最為敏感，sludgeSal.較stdSal.的耐藥性更強，說明剩余污泥環境馴化的沙門氏菌菌株相對而言耐藥性提高，這與環境中抗性基因的傳播有關。參考CLSI的MIC解釋標準，4種試驗菌株均對硫酸慶大霉素敏感。
微孔OD值與菌液濃度呈線性關系，且試驗采用的菌種均提前一天活化，同時經12h培養并處于對數生長期，通過延長硫酸慶大霉素濃度稀釋梯度，建立濃度與微孔OD值變化量之間的指數關系，將蚯蚓活性物質抑菌能力轉化為硫酸慶大霉素濃度進行對比，曲線方程如式（2）所示。針對各菌取MIC后的7個稀釋梯度進行擬合，OD實測值與擬合曲線見圖2。
式中：y為OD值變化量；x為硫酸慶大霉素濃度，μg/mL。
1.4 蚯蚓活性物質組分分析方法
1.4.1 GC/MS分析脂肪酸組分
定性分析：對檢測出的成分采用MS數據庫NIST11和保留時間進行定性。數據庫篩選結果中要扣除雜質峰、柱流失峰。
定量分析：采用面積歸一化法定量，即以鑒定成分峰面積占所有鑒定成分面積之和的百分比作為定量結果。
式中：Ci為某一鑒定成分含量，%；Ai為對應某一鑒定成分的峰面積；n為鑒定成分總數。
1.4.2 iTRAQ蛋白質組學分析
由于本試驗樣品為蚯蚓體腔液，在搜庫比對時，選擇蚯蚓所屬的環節動物門蛋白數據庫進行蛋白質組學分析。
2、結果與討論
2.1 裝置運行效果及對病原菌的抑制能力
裝置運行效果由SS、VSS及VSS/SS進行表征。其中，VSS代表污泥中的有機固體含量，是污泥減量的重要指標；VSS/SS是污泥穩定化指標，其值越低即表明污泥礦化程度和穩定化效果越好。在進泥濃度為（424±12）mg/L、水力負荷為2.0m3（/m2·d）、有機負荷為0.3kgVSS/（m3·d）的條件下，VF的SS和VSS減量率分別為（46.1±2.5）%、（57.5±1.7）%，VSS/SS值為53.1%；無蚯蚓的生物濾池（BF）的SS和VSS減量率分別為（31.9±1.6）%、（36.6±1.4）%，VSS/SS值為62.0%。相比之下，VF具有更好的污泥穩定化處理效果。
根據相關文獻篩選市政污水和污泥中的典型病原菌及指示菌共11種。BF對11種病原菌及指示菌的平均去除率為40.2%，VF對其平均去除率為58.0%，較BF具有更高的病原菌削減作用。在11種病原菌中，VF對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌和大腸桿菌的去除率相較于BF有顯著提高，分別提高了37.2%、27.1%、24.3%和19.8%，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌在VF出泥中的相對豐度較BF出泥有明顯降低，即引入蚯蚓使VF對這3種病原菌具有更優的抑制削減作用。
2.2 蚯蚓脂肪對典型病原菌的抑制能力
根據1.3節的方法測定蚯蚓脂肪對試驗菌株的抑菌能力，結果顯示，濾池蚯蚓脂肪（VEL）和對照蚯蚓脂肪（CEL）均對stdSau.無抑制作用，與相關研究結果一致；VEL對于sludgeSal.、stdSal.和stdEco.的抑制能力分別等同于（0.22±0.02）、（0.18±0.02）、（0.13±0.01）μg/mL硫酸慶大霉素藥液；CEL對其抑制能力分別等同于（0.23±0.01）、（0.23±0.01）、（0.13±0.01）μg/mL硫酸慶大霉素藥液。根據統計學檢驗結果，蚯蚓脂肪對sludgeSal.、stdSal.的抑菌能力在CEL組和VEL組具有顯著差異，但對stdEco.則沒有，而且CEL對前兩種菌的抑制效果更好，由此認為濾池的馴化并未提高蚯蚓脂肪的抑菌能力。
2.3 蚯蚓脂肪酸組分與抑菌能力分析
對VEL和CEL進行GC/MS測定，結果顯示VEL中含25種脂肪酸、CEL含10種脂肪酸，其中相同的脂肪酸有10種。共有脂肪酸在CEL中的相對占比約為21.6%，而在VEL中的相對占比約為34.6%。對比差異脂肪酸組成，VEL擁有15種特有脂肪酸，且4種為中鏈脂肪酸，分別為環己甲酸、苯甲酸、癸酸、十一酸，但這4種中鏈脂肪酸的相對占比僅為0.55%，其余均為長鏈脂肪酸。VEL的脂質總含量、脂肪酸組分多樣性和相對豐度都普遍高于CEL，但在抑菌效果上卻沒有表現出更強的優勢，且脂肪主要分布在蚯蚓的體壁和消化道中，這些部位是蚯蚓抵抗外來物質入侵的主要物理屏障，由此認為VEL脂肪酸及相對占比增加與適應濾池及剩余污泥環境有關，并不直接參與抑菌過程。
2.4 蚯蚓體腔液及其蛋白粗組分的抑菌能力
濾池蚯蚓體腔液（VECF）和對照蚯蚓體腔液（CECF）對不同試驗菌種的抑制能力具有一定差異，其中CECF對sludgeSal.、stdSal.、stdEco.和stdSau.的抑制能力分別等同于（0.28±0.01）、（0.31±0.01）、（0.33±0.02）、（0.16±0.01）μg/mL硫酸慶大霉素藥液；VECF對4種菌的抑制能力分別等同于（0.35±0.01）、（0.34±0.01）、（0.38±0.01）、（0.17±0.01）μg/mL硫酸慶大霉素藥液，比BF分別高出25.0%、9.7%、15.2%和6.3%，平均高出14.1%。兩類蚯蚓體腔液對stdSau.的抑制作用均低于其他3種菌，推測是由于革蘭氏陽性菌較革蘭氏陰性菌具有寬而致密的細胞壁，因而更不容易成為抗菌藥物的靶標；而且根據統計學檢驗，蚯蚓體腔液對sludgeSal.、stdSal.和stdEco.的抑菌能力在VECF組和CECF組具有顯著差異，而對stdSau.則沒有；對于除stdSau.外的其他3種菌，VECF都表現出更高的抑制作用，由此認為濾池的馴化提高了蚯蚓體腔液的抑菌能力。
測定不同分子質量范圍的粗蛋白對試驗菌種的抑制能力后，換算為同等抑制能力的硫酸慶大霉素藥液濃度，如表1所示。可以看出，VECF中除0~3ku之外的3個分子質量范圍粗蛋白對sludgeSal.的抑制能力均高于CECF，這與VECF對sludgeSal.具有更高抑菌能力的結果一致；VECF中3~10ku粗蛋白對sludgeSal.的抑制能力以及10~30ku粗蛋白對StdEco.的抑制能力分別約為CECF的1.7倍和1.4倍，說明為了適應剩余污泥和濾池環境，濾池蚯蚓提高了分子質量在3~10、10~30ku范圍的抑菌蛋白表達。
2.5 體腔液iTRAQ蛋白質組與抑菌能力分析
2.5.1 數據質控評估與樣本對比
為進一步了解蚯蚓體腔液蛋白組分，對VECF和CECF進行iTRAQ蛋白質組分析。分別設立3組生物學重復，運用統計學的方法，通過肽段匹配誤差分布、肽鏈長度分布對高分辨質譜所檢測的結果進行統計和質控。圖3宏觀反映了檢測結果和數據的質量，可以看出，肽段誤差能夠控制在20×10-6范圍內，酶解肽鏈長度符合多數分布在5~20bp的質控要求。
為了分析蚯蚓體腔液樣本的相關性，繪制主成分分析圖（如圖4所示），各個樣本點之間的距離越近表明樣本相似性越高。由圖4可見，同組樣本之間具有良好的重復性，而且CECF組和VECF組樣本之間具有明顯差異。
2.5.2 全蛋白組鑒定及功能注釋
試驗iTRAQ選取環節動物蛋白庫進行注釋，共注釋到276種蛋白，分子質量分布見圖5。
GO數據庫共注釋到203種蛋白。從分子功能層面注釋，二級條目中結合功能和酶的活性分別注釋到158和122種蛋白，是蚯蚓體腔液蛋白的主要分子功能。結合功能三級條目以離子、雜環化合物、有機環狀化合物和碳水化合物衍生物結合為主，與有機物代謝生物過程富集蛋白結果一致；酶的活性三級條目以水解酶、轉運酶和氧化還原酶活性為主。而動物處于應激狀態的典型特征是機體的氧化還原平衡被破壞，通過調控氧化還原酶和抗氧化酶的活性保證機體氧化還原平衡，提高免疫水平，研究證實蚯蚓也具有通過調控氧化還原平衡進行應激免疫調節的能力，可從分子功能層面證實蚯蚓體腔液對免疫系統的重要作用。
2.5.3 差異蛋白的篩選鑒定
以CECF為參照分析VECF中的差異蛋白，采用上調蛋白FC>1.2、下調蛋白FC30ku的有6種，在0~3、3~10、10~30ku范圍各1種。VECF與CECF鑒定的差異蛋白中有7種蚯蚓蛋白顯著上調，具體包括4種胞外珠蛋白片段和3種血紅蛋白連接鏈蛋白片段，血紅蛋白屬于珠蛋白，珠蛋白是具有攜氧能力的蛋白質，即上調的蚯蚓蛋白均與機體氧氣運輸有關。而且胞外珠蛋白-4在蚯蚓處于金屬鎘污染和病原菌EscherichiacoliO157：H7刺激時同樣表達上調，其機理尚不清楚，但推測更高的珠蛋白表達為蚯蚓機體提供更多貯存氧氣，從而滿足應激調節等生理功能需求。3種顯著下調蚯蚓蛋白分別為lysenin相關蛋白、肌動蛋白和一種未準確定性的胞外蛋白。蚯蚓受致病菌EscherichiacoliO157：H7和高濃度土霉素刺激后一段時間內lysenin相關蛋白和肌動蛋白也均出現表達下調，說明濾池環境中蚯蚓機體呈現應激狀態。
2.5.4 差異蛋白的功能注釋分析
由差異蛋白的GO注釋發現，大多注釋到的生物過程均同時具有上調與下調蛋白，但調節生物過程和信號發送過程中均只有差異上調蛋白R7T3U1和A0A2C9K037。A0A2C9K037是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），在基因表達調控和細胞質功能活動中發揮關鍵作用，蚯蚓免疫應激研究中也鑒定出多種MAPK通路蛋白。組蛋白和MAPK都具有遺傳序列保守性，在不同物種間保持較為相似的結構和序列，因而雖然以上兩蛋白注釋為其他物種，在蚯蚓體內應具有相似的功能。由此推測VECF中細胞較CECF具有更高的應激活性。
另外對差異蛋白進行KEGG通路富集（見圖6），可知蛋白富集率最高的均為代謝通路，其中，萜類化合物是動植物體內廣泛存在的化學物質，具有殺菌作用，其下調與免疫機能受損有關；酮體是脂肪代謝產物，可成為能源物質參與代謝，能源代謝的提高有利于生物體抵抗病原體感染。置信度最高的KEGG差異通路為細菌侵襲上皮細胞通路和沙門氏菌感染通路；肌動細胞上調除了與囊泡和SCV合成相關，也間接引發伴隨細胞膜起皺的巨胞飲作用，巨胞飲作用是病原菌進入宿主細胞的快捷途徑。KEGG富集通路證實濾池蚯蚓除了表現出更高的代謝能力外，也面臨更強烈的病原菌脅迫，因而對病原菌（尤其是沙門氏菌）具有更高的免疫反饋。
3、結論
①VEL中蚯蚓脂肪酸含量會增加以適應濾池及剩余污泥環境，但與抑菌免疫無直接關聯；VECF較CECF表現出更明顯的抑制作用，結合VF對病原菌的去除效果，認為VECF對剩余污泥中沙門氏菌、大腸桿菌的去除具有直接貢獻，但對金黃色葡萄球菌的去除貢獻不顯著，VF對金黃色葡萄球菌的去除機理有待進一步探究；VEL抑菌水平明顯弱于VECF，即體腔液對蚯蚓免疫發揮主要作用。
②通過蛋白質組分析得出，濾池蚯蚓提高了分子質量在3~10、10~30ku范圍的抑菌蛋白表達。當前蚯蚓體腔液中抗菌肽的研究表明，大多數已分離的蚯蚓抗菌肽分子質量30ku四個范圍。iTRAQ蛋白質組的鑒定結果表明，蚯蚓體腔液中含有較多分子質量>30ku的蛋白質，對大于30ku的不同分子質量范圍蛋白的抑菌作用有待進一步試驗確定，未來可進行更加深入的研究。（來源：同濟大學環境科學與工程學院，上海市城市建設設計研究總院<集團>有限公司）
