過氧化物酶是一類含血紅素的氧化還原酶，能夠以過氧化氫為電子受體氧化多種有機和無機分子，在免疫檢測、生物傳感器、工業廢水處理等方面有著廣闊的應用前景。目前使用的大多數過氧化物酶來源于植物，其生產受地域和氣候的限制，給工業應用帶來不便。灰蓋鬼傘過氧化物酶因與辣根過氧化物酶在酶學特性和底物廣譜性上十分相似而引起了人們的廣泛關注，盡管二者同源性低于10%−16%。研究發現，CIP已經成功用于清除廢水中的酚類物質、降解苯類同系物及衍生物、染料脫色;生產功能性多聚芳香物;用作生物傳感器和清潔劑;此外，CIP在紙漿造紙工業也極具應用潛力。從商業角度看，CIP有望替代HRP成為工業用酶，有著廣闊的市場前景。
近年來酶法處理染料廢水因條件溫和、環境友好而發展迅速，漆酶、過氧化物酶被廣泛試用于染料脫色。令人遺憾的是染織工業廢水pH大多是中性甚至堿性，漆酶和過氧化物酶卻多為酸性酶，在中堿性條件下會快速失活;而CIP的最適反應pH接近中性，熱穩定性比HRP更強，相對于其它酶CIP更適合用作染織業廢水脫色處理。美中不足的是灰蓋鬼傘屬于中溫菌，其產生的CIP在高溫和堿性環境下不夠穩定。利用分子定向進化技術進行CIP酶學性質的分子改良是改變最適反應pH、提高酶的熱穩定性和堿性環境耐受性的重要途徑Cherry等利用定向進化技術得到了一個氧化穩定性提高100倍、熱穩定性提高174倍的突變CIP;Houborg等研究了該突變體酶的晶體結構，揭示了蛋白結構改變對酶學性質的影響。但是該突變酶在高溫下仍不夠穩定，40°C處理5min活性下降為87%。目前國際上尚沒有關于CIP的最適反應pH向中、堿性方向偏移，最適反應溫度大幅提高且高溫穩定性增強的分子定向進化研究。
Cherry等報道M166F和M242I能夠提高CIP的氧化穩定性，V53A可以提高酶活性;Houborg等研究晶體結構時提出I49S和V53A會協同發生作用。本文以含有4個氨基酸突變(I49S、V53A、M166F和M242I)的CIP基因為模板，在保證了氧化穩定性和提高酶活性的基礎上進行基于易錯PCR的定向進化，以期尋找最適反應pH向中、堿性方向偏移，最適反應溫度升高，更適應染料脫色處理的工業用CIP。
染料脫色實驗
選pH2.2−8.0的檸檬酸-磷酸作緩沖液，分別用CIPwt和CIPmt5的粗酶液對7種染料進行脫色能力測定。200mL反應體系含合適初始濃度染料(剛果紅7.18mmol/L，氨基黑8.11mmol/L，甲基橙15.28mmol/L，次甲基藍14.98mmol/L，苯胺藍6.78mmol/L，結晶紫12.26mmol/L，溴酚藍7.46mmol/L)，雙氧水10mmol/L，CIPwt組酶用量為0.045U/mL，CIPmt5組酶用量為0.042U/mL，室溫(25°C)下孵育4h，測量脫色前后染料的濃度，
計算染料脫色率，計算公式如下：脫色率(%)=(脫色前吸光度–脫色后吸光度)/脫色前吸光度×100。
每個實驗3個重復，剛果紅、氨基黑和甲基橙采用490nm波長，次甲基藍和苯胺藍采用405nm波長，結晶紫和溴酚藍采用630nm波長，脫色率最高的緩沖液pH被認定為最適pH。具體聯系污水寶或參見http://m.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
討論
酵母在表達含稀有密碼子的外源基因時，細胞中氨酰tRNA對氨基酸的正常轉運可能受到限制，致使翻譯提前終止。大量實驗證明，密碼子優化可以顯著提高蛋白在酵母中的表達[37,39]。在實驗中將CIP密碼子調整為畢赤酵母偏好性，保證了突變CIP能夠在酵母中成功表達并完成表達后的翻譯、翻譯后加工、分泌等過程。根據Cherry等的報道向CIP中引入了4個氨基酸突變，為定向進化奠定了基礎，使得到的酶有可能在最適反應pH向中、堿性方向偏移，最適反應溫度升高的同時保持氧化穩定性。Cherry等對CIP進行定向進化時發現單個V53A可以提高酶活性，但不會引起穩定性的改變，而M166F似乎和I49S、V53A協同發生作用，對穩定性增強貢獻最大。用Swiss-model建模分析發現I49S、V53A導致酶蛋白缺失一個與原卟啉IX結合的氰根離子配體，使突變酶活性中心更開放，所以表現出Km值下降，親和力增強。第49、53和121位的3個疏水性氨基酸同時變成親水性氨基酸，使蛋白側鏈變小，從而增加了蛋白的穩定性。分子動力學模擬進一步驗證了這一觀點。Cherry等分析E239G能夠改善CIP在高pH時的熱穩定性，而本實驗在定向進化中得到了一個含有E239G的突變3-26-G5(I49S、V53A、M166F、E239G、M242I和Y272F)，最適反應pH為6.5，酶活性是野生型的1.13倍(13.74U/mg)，最適反應溫度為40°C，但是后期實驗發現其在各pH和溫度處理后穩定性尚不如野生型(數據未顯示)。E239G的引入并沒有提高熱穩定性，可能是各突變位點之間存在著復雜的相互作用，機理仍需進一步研究。
染料廢水處理是環境保護領域的一大難題，理化方法成本昂貴且會形成二次污染;酶法處理染料逐漸引起人們的重視。植物來源的過氧化物酶生產周期長、成本高不適合工業化應用。而真菌來源的漆酶和過氧化物酶多為酸性酶，在中、堿性環境會快速失活。本實驗用定向進化的手法得到了酶學性質顯著改善的突變灰蓋鬼傘過氧化物酶，并對不同類型的7種常用染織染料進行脫色檢測。雖然CIPmt5可能會在較高溫度時(比如37°C和45°C)具有更高的活性和高的脫色效率，但考慮到室溫能耗低、利于降低處理成本，因此選擇了在室溫(25°C)下對染料進行處理。因酶法脫色染料反應體系和條件不同，無法與其他人的具體結果進行比較，從本實驗結果來看突變后的酶取得了比野生型酶更好的脫色效果，反應條件更接近實際排放的染料工業廢水狀況，從方法的適應性和節約成本出發，CIPmt5更適合染料工業廢水的處理應用。
