我國是煙草種植、生產和消費大國, 種植面積和產量均居世界首位.煙草行業是我國納稅大戶, 在“十二五”期間煙草行業五年上繳財政總額4.13萬億元, 年均增長17.5%, 比同期全國財政收入年均增長率高4.7%, 在國民經濟中發揮著重要作用.然而在煙草制品生產過程中會產生大量廢水 , 國家統計局2013年報道我國煙草制品業廢水排放量為2362×104 t.煙草工業廢水排放量大且顏色深、成分復雜, 煙葉中的尼古丁、有機酸、氨基聯苯、萘胺等成分造成廢水毒性大, 污染嚴重, 被歐盟法規認定為“有毒危險性廢物”(Novotny et al., 1999), 若不妥善處理, 極易對環境造成嚴重的污染和潛在的危害(Wang et al., 2012) .尼古丁是煙草廢水中一種關鍵的污染物, 溶于水和多種有機溶劑, 甚至可穿過復雜的生物膜, 包括血-腦屏障, 具有致癌、致畸、致突變性, 對人體造成危害(Tega et al., 2013) .因而有效處理該類廢水, 使處理后污水無毒排放或中水回用, 對煙草工業綠色健康發展具有重要的意義.

　　目前已有多種方法應用于煙草廢水處理領域, 工程常采用物理-化學-生物方法聯合處理工藝, 其中生物法由于其經濟高效的特性成為目前該類廢水處理的主流技術, 并作為主體工藝技術應用于生產實踐中.然而由于尼古丁及多環芳烴等污染物的難降解性和生物毒性(Yuan et al., 2006; Qu et al., 2006), 導致活性污泥的處理體系出現出水水質差、系統運行不穩定等問題, 使傳統生物處理技術面臨巨大挑戰(郭靜波等, 2011) .而生物強化技術被認為是最直接有效改善活性污泥性能, 提高系統運行效率的技術(Limbergen et al., 1998) .目前生物強化局限于單一菌株對活性污泥的強化處理(Wang et al., 2013), 并主要關注對單一污染物尼古丁的降解效能和機理分析, 如篩選獲得以節細菌(Arthrobacter sp.)(Ruan et al., 2006; Hochstein et al., 1959), 假單胞菌(Pseudomonas sp.)(Chen et al., 2008; Ruan et al., 2005) 為主的尼古丁降解菌類群.然而作為生物強化的菌種只有能夠長期穩定適應處理環境才能發揮較好的作用(Fantroussi et al., 2005) .煙草廢水處理運行過程受產能、生產周期和煙草質量影響, 水質波動較大且成分復雜, 除了含有高濃度的尼古丁外, 還含有其他多種有毒有害污染物.單一菌株的處理往往不能達到預期效果.與之相比, 菌群的環境耐受能力強, 處理效果穩定, 在環境治理研究中取得較好的處理效果(Seib et al., 2015; Zhao et al., 2016) .

　　目前鮮有利用菌群進行煙草廢水處理或生物強化的應用研究, 本研究旨在通過篩選馴化的方式獲得高效活性降解菌群, 并分析處理前后煙草廢水理化參數和有機成分的變化, 利用克隆文庫技術分析菌群構成及多樣性指數, 解析菌群處理過程中煙草廢水污染成分的變化及降解過程.本研究獲得的菌群由于其構成的穩定性和代謝途徑的多樣性, 能夠適應不同濃度的廢水環境, 去除尼古丁的同時有效降解其他多種雜環化合物、芳香烴及酯類等污染物, 拓展了降解范圍, 為菌群在煙草制品廢水處理中的應用提供了理論指導.

　　2 材料和方法(Materials and methods) 2.1 水質分析

　　廢水來自于某煙草公司, 該公司產生的廢水黃褐色, 渾濁并伴有典型煙草氣味.廢水基本理化參數檢測按照《水和廢水監測分析方法》規定進行(國家環保局, 1997) .其中COD、色度、懸浮物(SS)采用便攜式水質分析儀(DR1900, 美國Hach公司)進行測定;生化需氧量(BOD5)采用BOD測試儀(美國Hach公司)進行測定;pH值采用pH電極法測定, pH計(FE20, Mettler Toledo);鹽度采用折光率法進行測定, 鹽度計(手持式鹽度儀, 南京山特公司);氨氮含量采用納式試劑分光光度法(GB 7497-87) 測定;可溶性磷酸鹽采用鉬酸銨分光光度法(GB 11893-89) 測定.

　　2.2 有機污染物分析

　　利用固相萃取和氣相色譜-質譜聯用法(Gas Chromatography-Mass Spectra, GC-MS)分析有機污染物.

　　水樣預處理：取3份水樣各500 mL, 分別用H2SO4和NaOH調節至pH小于2、自然pH和pH大于11, 用0.45 μm濾膜過濾后分別用固相萃取柱(Agela Cleanert C-18) 萃取(Yang et al., 2013) .固相萃取柱活化后, 水樣以5.0 mL·min-1的流速滲透過固相萃取柱, 使污染物吸附于萃取柱中.預富集后抽真空10 min使小柱干燥, 依次加入乙酸乙酯、正己烷和甲醇, 每種有機溶劑自然流下后收集洗脫的樣品, 將同一個樣品的淋洗液合并, 加入無水硫酸鈉脫水, 最后氮吹儀吹干濃縮過濾后用于定性定量分析微生物降解前后水樣中的污染物類別和含量.實驗中用到的所有有機溶劑均為色譜純.

　　GC-MS/MS聯用儀(Agilent 7890A GC/7200 Q-TOF MS)分析污染物種類和含量.方法參照文獻進行并略有調整(Yang et al., 2013), 儀器設置參數如下：①進樣口溫度：250 ℃;分流比：100:1(V/V);色譜柱：30 m×250 μm×0.25 μm (J&W HP-5, 320 ℃);載氣：氦氣;流速：1.2 mL·min-1;升溫程序：平衡時間0.5 min, 50 ℃ 維持1 min, 之后10 ℃·min-1升溫至130 ℃, 30 ℃·min-1 升溫至280 ℃ 維持6 min, 整個分析流程20 min.② Q-TOF質譜條件：接口溫度：280 ℃;離子源：EI, 70 eV;離子源溫度：200 ℃;四極桿溫度：150 ℃.分析流程開始階段, 設置溶劑延遲3 min.

　　2.3 功能菌群的篩選馴化和多樣性分析

　　根據廢水的性質和污染類型, 選取污水處理廠污泥樣品, 以逐步提高污染物負荷的方式篩選馴化具有高效降解功能的菌群(Gong et al., 2009), 在操作過程中通過調整廢水的稀釋倍數實現污染物濃度梯度逐步提高、增加馴化壓力的目的.10 g污泥樣品加入到稀釋4倍的100 mL廢水中, 180 r·min-1、30 ℃培養4 d后轉接到稀釋倍數為2的廢水中, 逐步提高濃度至不稀釋廢水培養基中, 不斷馴化菌群活性和環境耐受能力, 測定處理污水過程中COD濃度變化, 篩選降解效率最高的功能菌群.

　　采用細菌總DNA提取試劑盒(MO BIO PowerSoil®)提取菌群樣品DNA, 利用細菌通用引物27F和1492R擴增細菌16S rRNA 基因(Li et al., 2011), 并構建克隆文庫分析群落構成(劉開朗等, 2009) .克隆菌株送至諾和致源公司進行測序分析, 測序結果采用Blast方法在GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中進行相似性搜索比對, 根據基因測序比對結果分析群落多樣性和微生物群落結構組成.

　　3 結果與討論 (Results and discussion) 3.1 廢水樣品的基本理化參數檢測

　　廢水基本理化參數列于表 1.在煙草制品生產過程中一般會有較多煙草成分溶解于水中, 從表中結果可以看出, 菌群處理前廢水的懸浮物和化學需氧量都很高, 分別達到735 mg·L-1和2169 mg·L-1.結果顯示處理前的廢水色度為1250, BOD5也高達971 mg·L-1.廢水的B/C為0.45.B/C即BOD5/COD, 是衡量污水可生化性的重要指標, 即污染物中可生化降解組分占總污染物的比例, 當比值大于0.45, 生物降解性高;在0.45~0.30之間, 生物降解性一般;在0.30~0.20之間, 較難生物降解;比值小于0.20, 極難生物降解(陳壁波, 2006) .測定結果表明廢水水質可生化性較好, 適用于生物處理, 這同文獻報道中的煙草制品廢水屬性一致(侯軼等, 2008) .

　　表 1(Table 1)

　　表 1 廢水樣品的基本理化參數

　　3.2 菌群篩選與降解活性分析

　　以COD為指標, 篩選獲得3個具有降解效果的菌群, 分別命名為菌群A、B和C, 對煙草廢水COD的降解效果如表 2所示.3組功能菌群經過梯度馴化后對廢水COD的降解率均有提高, 且對COD為848、1692、2169 mg·L-1的廢水均有較好的處理效果, 適用濃度范圍大.其中菌群C在不同的COD下均展現出最優的處理水平, 第4代處理廢水36 h后, COD由初始2169 mg·L-1降至366 mg·L-1, 去除率為83.1 %, 在3個菌群中降解效果最好.基于此, 后續以菌群C作為重點菌群, 深入研究處理煙草廢水降解效果、污染物組成變化及其微生物群落結構.

　　表 2(Table 2)

　　表 2 馴化菌群對煙草廢水的處理效果

　　圖 1(Fig. 1)

　　圖 1 菌群C對廢水樣品主要污染指標的降解曲線

　　3.3 菌群處理前后污染物分析比較

　　準確分析廢水中有機物組成及變化, 了解污染物代謝過程并為后續處理的方向和工藝調整提供指導.污染物分析檢測的總離子流圖如圖 2所示, 其中每個離子流峰代表一種污染物, 每個峰積分面積代表污染物相對含量, 從下圖比較可以看出, 經過菌群C作用后, 有機物種類大幅減少, 含量明顯降低.

　　圖 2(Fig. 2)

　　圖 2 菌群處理前后污染物GC-MS總離子流圖比較

　　去除空白樣品中有機物后, 將處理前后廢水有機物組成和含量列于表 3中.整體上分析處理后廢水中污染物含量是處理前10%~15%, 顯著下降, 降解率接近90 %, 這與COD的降解率基本相符, 說明污染物種類含量和COD指標正相關.污染物種類也從降解前的49種變為降解后的37種.從結果可以看出, 處理后有機酸的種類由10種降至6種且相對含量由1235×104降至67×104, 有機酸被有效降解, 與處理后pH有所上升對應, 并且有機酸是煙葉組成中重要的香氣化合物(王利杰等, 2007), 這也是經菌群處理后廢水的氣味減弱的原因之一.此外, 處理后廢水中的含氧雜環和磺基類物質被完全降解;在處理后的廢水中酯類和芳香烴的種類和相對含量均有所下降, 酯類化合物的種類由4種減少到1種, 相對含量由43.8×104降低為2.2×104;芳香烴的種類由6種減少到4種, 相對含量由58.1×104降至12.1×104.處理后酮醛類物質含量豐富, 并出現醚、烯烴和苯酚.

　　表 3(Table 3)

　　表 3 廢水處理前后物質組成分析

　　總體看來, 經過菌群C處理后, 廢水中對COD貢獻率較高的如尼古丁、吲哚、喹啉、酯及芳香烴等物質含量顯著降低, 轉變為COD貢獻率較低小分子物質, 不僅極大減輕了出水指標的壓力, 且去除了尼古丁為代表的毒性物質.未來研究可針對性的強化對噻唑、酮類及烴類物質的降解能力, 進一步降低廢水COD, 使其能夠穩定達到排放標準.

　　3.4 高效活性菌群構成的測定

　　將高效菌群C文庫中的78個陽性克隆進行測序, 分析后共得到47個OTU.樣品微生物多樣性分析結果顯示：其香農-威納指數(Shannon-Wiener Index)、辛普森多樣性指數(Simpson Index)和菌群豐富度指數(ACE)分別為3.645、0.978、106.其中香農-威納指數高, 說明群落結構復雜;辛普森多樣性指數達到了0.978, 說明群落中細菌種類多, 且個體分布均勻;污泥樣品中的菌群豐度指數(ACE)表明樣品具有較高的微生物種群豐度.總之, 微生物多樣性分析結果表明, 菌群中的微生物的群落結構復雜, 物種豐富度高, 且分布均勻, 適合使用于實際廢水處理中.

　　菌群的克隆文庫中的克隆主要屬于細菌域的7個主要類群, 如圖 3所示, 變形菌門(Proteobacteria)占有最大比例為48.75%, 其次為放線菌門 (Actinobacteria)占到總數的11.51%.另外還包含硝化螺旋菌門 (Nitrospira), 擬桿菌門 (Bacteriodetes), 綠彎菌門 (Chlorobacteria)等. 具體參見污水寶商城資料或http://m.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　圖 3(Fig. 3)

　　圖 3 高效菌群C結構組成

　　在克隆文庫中比例最高的變形菌門是細菌中最大的一門, 比例為48.75%, 而這與一般處理污水的活性污泥的構成類似(Zak et al., 1994), 即活性污泥的優勢類群也是變形菌門.變形菌門細菌的細胞形態極為多樣, 參與了大多數化合物的降解代謝, 具有多種代謝方式.變形菌門檢測到Brevundimonas aveniformis、Thiobacillus sp.、Desulfomicrobium sp.、Xanthobacter sp.及Burkholderiales sp.等微生物, 比例分別為1.3%、11.5%、1.3%、1.3%和1.3%, 具有降解多環芳烴(Xiao et al., 2010) 、脫氮除硫(范立民等., 2013) 、脫硫解毒重金屬離子(徐衛華等, 2009) 、降解含氧雜環化合物(金小君等, 2012) 及降解酚類(Elsayed et al., 2003)等功能.

　　在克隆文庫中比例排第二位的為放線菌門(Actinobacteria), 比例為11.51%, 這也是污水處理系統中常見的微生物類群(Wagner et al., 2002) .在克隆文庫中檢測到了Nocardioides sp.、Microbacterium sp.等微生物種類, 兩者比例均為1.3%, 這些微生物在降解雜環芳香化合物(Rhee et al., 2011)和芳香烴(李麗等, 2001)等多種復雜有機物中均有報道.另外擬桿菌門的Flavobacterium sp. 比例為2.6%具有降解石油烴的功能(李麗等, 2001) .

　　正是微生物群落的結構多樣性和代謝活性復雜性, 使其在降解過程中的形成“共代謝機制”, 高效降解了廢水中的有毒有害有機物, 并保障了降解的穩定性和徹底性.目前尼古丁的細菌降解途徑有兩種, 一種是放線菌門節桿菌屬為代表的吡啶途徑(Brandsch, 2006), 另一種是變形菌門假單胞菌為代表的吡咯途徑(Wang et al., 2005) .在克隆文庫中發現Nocardioides sp., 該菌也被報道有降解尼古丁的能力(Ganas et al., 2008), 并遵循吡啶途徑, 然而在菌群處理廢水過程中, 并沒有發現該途徑常出現的藍色物質, 是否由于菌群自身的復雜性, 使其并未按照單菌的代謝途徑降解廢水中的污染物, 有待進一步深入研究.

　　4 結論(Conclusions)

　　1) 從環境樣品中獲得一組高效降解菌群C, 該菌群能夠適應實際廢水的環境, 對廢水的COD和色度具有較好的去除效果, 降解率分別為83.1%和36.8%, 且處理后的廢水其他指標包括氨氮和磷酸鹽等均有所下降.

　　2) 經過GC-MS分析可知, 菌群對總有機物的去除率近90%, 且能夠完全去除廢水中的尼古丁, 并對其他含氮雜環物質有很好的降解效果, 能夠將廢水中的有毒大分子物質轉化為COD貢獻率較低的小分子物質.

　　3) 菌群的多樣性分析表明, 微生物的群落結構復雜, 物種豐富度高, 且分布均勻.分析菌群構成可知, 變形菌門在菌群構成中所占比例最高為48.75%, 其次為放線菌門, 比例為11.51%.在菌群組成中發現能夠降解尼古丁的菌株Nocardioides sp., 然而該菌降解尼古丁的吡啶途徑并沒有在菌群C處理廢水過程中完整的體現, 因而由多種物種構成的微生物菌群對尼古丁的代謝機制有待進一步研究.

　　4) 菌群C群落組成豐富, 分布均勻, 包含多種不同功能的微生物菌株, 不僅能夠針對性的去除尼古丁等有毒有害化合物, 并且有效降低其他各項污染物含量.由于其穩定的微生物群落結構能夠適應不同濃度的廢水, 未來可以用于強化活性污泥功能、減少剩余污泥、改善出水水質, 具有巨大的工業生產應用潛力.