1 引言
核磁共振(NMR)技術是現代科學中用途廣泛的分析工具，它可以快速準確的用于土壤、動植物組織、沉積物等環境樣品的分析，該技術檢測尺度和使用范圍較廣.自然界中的磷僅有一種穩定同位素(31P)，其原子核質量數為奇數，原子核的自旋量子數為半整數，所以在外加磁場條件下可以產生核磁共振現象.雖然31P-NMR技術被應用于環境樣品有機磷分析，但有機磷提取效率較低和核磁共振圖譜質量不高等問題仍有待于進一步提高和完善.
有機磷是土壤及河湖沉積物的重要組成部分，在沼澤、土壤及湖泊沉積物中可以占到10%~90%.對有機磷的研究有助于人們深入認識磷的生物地球化學循環過程及其環境效應.傳統的有機磷分析方法基于不同有機磷組分在酸堿提取液中的溶解性進行分離.這些方法雖然可以為認識磷在環境中的轉化過程提供信息，但不能區分有機磷的組分及各組分在轉化過程中的作用及影響因素，從而制約了人們對有機磷的深入研究.液相31P-NMR技術最低檢出限較高，在進行分析前必須對環境樣品的有機磷進行濃縮處理.而土壤樣品具有復雜的物理化學性質，且含有鐵錳等順磁性離子，這些因素會影響核磁共振分析的效率.為了達到既能獲得理想的有機磷提取效率，又可以降低提取液中的順磁性離子(Fe3+、Mn2+等)干擾的目的，一些學者嘗試用不同提取劑進行有機磷提取，主要包括NaOH(Ahlgren et al., 2005)、離子交換樹脂(Adams and Byrne， 1989)、螯合劑+NaOH(Gressel et al., 1996)、NaOH+NaF(Sumann et al., 1998)、NaHCO3(Makarov et al., 2002)、BD(Reitzel et al., 2006)、H2SO4(Makarov et al., 2002)和EDTA+NaOH(Cade-Menun et al., 2000; Koopmans et al., 2007)等.在提取過程選擇上包括一步提取和多步提取等(Bai et al., 2009; Zhang et al., 2009).以上提取劑最初被應用于土壤樣品分析，而沉積物有機磷的提取和分析完全借鑒于土壤科學.目前仍然缺乏以高磷含量的河流沉積物為研究對象，進行有機磷核磁共振分析的研究.
本研究以磷污染較為嚴重的海河流域滏陽新河沉積物為研究對象，參照文獻報道并結合目標沉積物理化特性，分別選擇BD、EDTA、EDTA+Na2S2O4、 C4O6H4KNa·4H2O、Na2S·9H2O和NaOH為提取劑，采用兩步提取的方式，利用液相31P-NMR技術系統評估不同提取劑和提取方式對沉積物樣品總磷、有機磷、金屬離子和核磁共振圖譜質量的影響，以期在選擇和優化理想沉積物有機磷提取劑和提取方式的基礎上，探索沉積物有機磷的提取機理.本研究結果將為構建科學和普適的環境樣品有機磷分析方法體系提供重要參考.
2 材料與方法
2.1 樣品采集與處理
樣品采集自海河流域滏陽新河，滏陽新河是子牙河水系的重要河流，開挖自20世紀60年代，主要用于分流滏陽河、醴河等的洪水.隨著沿河社會經濟的發展，大量污水進入滏陽新河，導致河水水質下降.自滏陽新河上游至下游共布設5個樣點(1：37.500°N，115.058°E;2：37.681°N，115.665°E;3：37.827°N，115.862°E;4：37.930°N，115.967°E;5：38.117°N，116.075°E)，利用彼得遜采泥器采集表層約5 cm沉積物樣品.將樣品用密封自封袋保存，帶回實驗室利用冷凍干燥機冷干樣品.剔除沉積物樣品中的雜質后將5個樣品均勻混合，四分法取部分樣品研磨，研磨樣品過篩用于試驗分析.
2.2 沉積物物理化學性質分析
樣品分析指標包括pH、有機質(OM)、總磷(TP)、有機磷(Po)、鐵(Fe)、錳(Mn)、鋁(Al)、鈣(Ca)、鎂(Mg).pH：去CO2水與過20目篩沉積物以2.5 ∶ 1的水土比混合后pH計測定(Bai et al., 2009);TP和Po：TP的提取，將沉積物樣品置于馬弗爐中500 ℃處理2 h，樣品在干燥皿中放置常溫后使用1 mol · L-1 HCl提取16 h，沉積物無機磷(Pi)直接利用1 mol · L-1 HCl提取16 h，采用鉬酸鹽比色法分別測定提取液中的TP和Pi，沉積物有機磷(Po)為總磷和無機磷的差值(Aspila et al., 1976);OM：采用燒蝕法測定，將去除水分的沉積物樣品置于馬弗爐中550 ℃處理4 h，灼燒前后的質量差值即為OM(Jensen et al., 1992);金屬離子測定：沉積物樣品取0.1 g過100目篩后利用微波消解儀消解(MARSXpress，CEM，USA)，消解液為HNO3-HCl-HF，樣品消解完全后加1滴HClO4趕酸，利用ICP-OES/MS測定(USEPA，2007;Wen et al., 2012).
2.3 沉積物Po提取與液相31P-NMR分析
參照相關文獻報道的基礎上，分別利用BD、EDTA和Na2S · 9H2O等提取劑進行提取實驗(表 1).提取劑分別選擇BD(0.11 mol · L-1NaHCO3+0.11 mol · L-1Na2S2O4)，EDTA(50 mmol · L-1)，EDTA(50 mmol · L-1+Na2S2O4(2%，g/mL)，C4O6H4KNa·4H2O(0.1 mol · L-1)，Na2S · 9H2O(0.1 mol · L-1)，NaOH(0.25 mol · L-1).提取過程分為兩步：分別稱取6份等量(5 g)沉積物置于50 mL離心管，前5個樣品分別依次加入前5種提取劑，提取比例為1 ∶ 10，室溫、240 r · min-1下振蕩2 h，振蕩結束后將離心管置于冷凍離心機中4 ℃條件下8000 r · min-1離心30 min.過濾上清液用于TP、Po及金屬離子檢測，剩余沉積物與第6個樣品一同加入0.25 mol · L-1 NaOH 溶液(浸提比例為1 ∶ 10)，室溫、240 r · min-1下振蕩16 h.振蕩結束后置于冷凍離心機4 ℃條件下8000 r · min-1 離心30 min.過濾棄去沉積物殘渣，過濾液部分用于TP、Po及金屬離子檢測，剩余提取液冷凍干燥待用.2次提取液稀釋用于不同元素分析：TP測定需要首先利用過硫酸鉀高溫消解，提取液Po為TP和Pi的差值，TP和Pi含量采用化學分析儀測定含量(型號: SmartChem200;廠商：德國 AMS);金屬離子利用ICP-OES/MS分析;剩余提取液冷凍干燥機冷干至粉末，冷藏待用.
表 1 沉積物有機磷提取劑及提取過程
液相31P-NMR磷最低檢出限較高，為了保證不同提取液提取后核磁共振分析可以獲得理想的圖譜，用0.1 mL 10 mol · L-1NaOH+0.6 mL D2O的混合溶液溶解300 mg冷凍樣品.混合溶液超聲處理30 min，超聲結束后靜止平衡5 min，平衡結束后樣品溶液14000 r · min-1離心15 min，上清液轉移至核磁共振管檢測.檢測儀器為瑞士BRUKER公司生產的BRUKER AV400核磁共振儀.采用BRUKER標準腔5 mm的BBO探頭，31P譜的脈沖P1=12.00 usec，脈沖功率PL1=3.00 dB，31P的共振頻率為129.534 Hz，循環延遲dl=2 s，掃描20000次左右，測定溫度為20 ℃.化學位移均參照85%的H3PO4，樣品檢測所得峰值參考已發表文獻確定不同成分化學位移的組成(Turner et al., 2003; Cade-Menun.，2005)，對不同組分圖譜進行積分，用于計算沉積物中不同組分有機磷的含量.
3 結果與討論
3.1 沉積物物理化學特征
沉積物樣品基本理化性質如表 2所示.點面源污染物排放的加劇增加了河流沉積物磷的累積，本研究樣品沉積物總磷高達(4228.86±98.11)mg · kg-1，其中有機磷含量為(535.35±23.09)mg · kg-1，有機磷占到沉積物總磷的12.66%;沉積物OM值較高，為12.09%±1.18%.滏陽新河沿岸農田廣布、人口密集、城鎮化進程加快，產生了大量的工農業及生活污水，污水攜帶了大量污染物進入河流，導致河流沉積物有機質含量較高，這一現象在海河流域較為普遍(Qu and Kroeze， 2010; Pernet-Coudrier et al., 2012);沉積物pH為7.25±0.31，呈弱堿性;滏陽新河沉積物Fe、Al離子濃度高于Ca離子，Fe、Mn、Al、Ca、Mg的離子濃度分別為(57.59±1.23)、(0.63±0.11)、(27.12±2.76)、(14.15±2.87)和(3.90±0.66)g · kg-1，為典型的Fe/Al型沉積物.
表 2 河流沉積物理化性質
3.2 總磷(TP)和有機磷(Po)提取效率分析
不同提取劑前提取處理TP和Po的提取效率差異較大(圖 1).EDTA +Na2S2O4提取的TP量最大為(1160.52±32.00)mg · kg-1，其次為 Na2S · 9H2O提取的TP量為(846.34±18.18)mg · kg-1，BD和C4O6H4KNa · 4H2O提取的TP量分別為(322.87±13.82)和(306.42±5.09)mg · kg-1，EDTA前提取液中的TP含量最低，為(119.76±16.00)mg · kg-1.不同提取劑前提取后NaOH提取沉積物樣品所得到的TP濃度差別較大.與僅用NaOH一步提取相比，EDTA前提取后NaOH提取液中TP濃度較高，為(2477.40±112.72)mg · kg-1，BD和EDTA+Na2S2O4前提取后NaOH提取液中TP濃度分別為(2271.20±75.63)和(1909.71±31.27)mg · kg-1，與僅用NaOH提取相差不大，而其余兩個處理C4O6H4KNa·4H2O和Na2S · 9H2O前提取后NaOH提取液中TP濃度低于僅用NaOH一步提取的結果.
圖 1 不同提取液中TP和Po的含量
不同提取液處理對沉積物Po的提取效率差異明顯.5種前提取液中以Na2S · 9H2O前提取Po的損失最嚴重，損失量為(68.82±1.74)mg · kg-1，其次為C4O6H4KNa · 4H2O前提取液中Po損失量為(46.36±5.81)mg · kg-1，其余3種提取液BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取液中Po損失量基本一致，分別為(24.91±15.24)、(20.90±2.58)和(21.69±5.16)mg · kg-1.前提取液對NaOH提取Po的效率亦產生影響.與僅用NaOH(Po：(185.05±40.12)mg · kg-1)一步提取相比，EDTA提取后NaOH提取液中Po含量較高，為(186.93±20.53)mg · kg-1，其余4種提取劑提取后NaOH提取液中Po濃度分別為(152.04±1.55)(BD)、(157.92±46.27)(EDTA+Na2S2O4)、(121.47±21.21)(C4O6H4KNa · 4H2O)、(99.87±15.20)mg · kg-1(Na2S · 9H2O).
綜合來看，EDTA前處理顯著增加了TP的提取效率，與僅用NaOH提取對比，TP的提取量增加了10%.這一研究結論與相關研究一致(Turner et al., 2005; Ahlgern et al., 2007).EDTA作為一種應用廣泛的螯合劑，可以與沉積物中的金屬離子(Fe、Al等)螯合形成絡合物，從而促進了沉積物中鐵鋁結合態磷的釋放，增加了提取液中TP的濃度(Cade-Menun and Preston， 1996; Cade-Menun and Lavkulich， 1997).BD處理也可以促進沉積物磷的釋放，其機理與EDTA不同，BD可以使高價態金屬離子還原為低價態金屬離子，低價態金屬離子對磷的吸附能力小于高價態離子從而促進磷的釋放(Ahlgern et al., 2007).EDTA對沉積物中金屬離子的螯合作用大于BD，因此，EDTA提取液中TP的濃度顯著高于BD處理，且EDTA前提取液中TP的損失量小于BD.在本研究中，EDTA+Na2S2O4提取并沒有增加TP的提取量，且前提取液中TP損失較大.C4O6H4KNa · 4H2O和Na2S · 9H2O兩種提取劑在TP提取上效果均較EDTA和BD差.Po的提取效率與TP類似.沉積物有機磷亦可以被Fe離子等金屬離子結合，EDTA的存在螯合了金屬離子從而促進了有機磷的釋放(Turner et al., 2007).EDTA前處理在獲得較高Po提取量的同時Po損失量最少，而BD和EDTA+Na2S2O4前提取液中Po損失量較少，但NaOH提取液中Po的提取量也較小，C4O6H4KNa · 4H2O和Na2S · 9H2O兩種提取劑對Po的提取效率低于其他處理.
3.3 金屬離子提取效率分析
沉積物有機磷提取的最優效果是獲得較理想的有機磷提取量和低濃度的順磁性離子(Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ))，這些順磁性離子的存在會提高弛豫時間，增加譜圖的線寬使峰形重疊(Ding et al., 2010).不同提取劑Fe、Mn等5種離子的提取情況見圖 2.就Fe離子而言，EDTA+Na2S2O4前處理對Fe離子的去除效率最高，提取液中Fe離子濃度為(106677.21±215.82)mg · kg-1.5種前處理中EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取液中Mn離子濃度高于其它3個處理，分別為(243.02±2.80)和(266.61±1.84)mg · kg-1.Na2S · 9H2O前提取液中Al離子濃度最高為(217.65±7.12)mg · kg-1.5種提取劑前提取后NaOH溶液提取液中Al離子的濃度EDTA+Na2S2O和EDTA處理較高為(718.95±5.25)和(687.73±3.53)mg · kg-1，其余3個處理NaOH提取液中Al離子濃度均低于前兩個處理.EDTA和EDTA+Na2S2O4兩處理前提取液中Ca離子濃度較高，分別為(22062.99±486.93)和(18729.74±26.93)mg · kg-1.BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取液中Mg離子濃度較高，分別為(273.06±1.24)、(238.32±8.37)和(333.68±0.36)mg · kg-1，其余兩處理前提取液中Mg離子濃度較低.
圖 2 不同提取液中Fe、Mn、Al、Mg、Ca離子濃度變化
不同提取劑對順磁性離子的去除效率存在差異.EDTA是一種有效的絡合劑，擁有6個配位原子，可以和金屬離子形成穩定的水溶性絡合物，EDTA提高有機磷提取量的同時結合Fe、Mn等順磁性離子.在本研究中大量的Fe和Mn離子在EDTA提前提取中去除，從而減少了NaOH提取液中順磁性離子的干擾;BD為0.11 mol · L-1 NaHCO3和0.11 mol · L-1 Na2S2O4的混合溶液，可以將金屬離子從高價態還原成低價態從而促進磷的釋放，在本研究中，BD對Fe、Mn等離子的提取效率均小于EDTA的提取效率;EDTA和Na2S2O4的混合溶液表現出了對Fe和Mn離子更高的去除效率，原因為EDTA和強還原性的Na2S2O4混合保證了金屬離子的高去除率;而作為探索研究，C4O6H4KNa · 4H2O和Na2S · 9H2O對金屬離子的去除效果較差，也沒有較高的TP和Po提取效率.所以在對河流沉積物的有機磷提取中BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4對順磁性離子的去除效果較為理想.
3.4 沉積物有機磷提取圖譜分析
利用液相31P-NMR對NaOH提取液進行分析得到5種磷組分，分別是正磷酸鹽(Ortho-P: 6~7 ppm)、焦磷酸鹽(Pyro-P：-3.5~-4.5 ppm)、磷酸單酯(Mono-P：4~6 ppm)、磷脂(Lipids-P：1~ 3 ppm)和DNA-P(DNA-P：0~-1 ppm)(圖 3).從圖譜分析可以看出，提取劑對沉積物磷形態并沒有產生影響，提取劑前提取后，均可以得到5種磷形態. 不同提取劑對沉積物中不同磷形態含量造成的影響存在差異.EDTA和BD處理后顯著提高了沉積物NaOH提取液中Pi的提取量.EDTA處理后提高了沉積物NaOH提取液中焦磷酸的量;5種提取劑處理后并沒有提高磷酸單酯的量.EDTA、EDTA+Na2S2O4和C4O6H4KNa · 4H2O 3個處理顯著提高了磷脂的含量，分別由0.63 mg · kg-1增加到3.44、2.58和4.09 mg · kg-1;對DNA-P而言，僅EDTA處理提高了其含量(表 3).
圖 3 河流沉積物有機磷核磁共振磷化合物圖譜
表 3 液相31P-NMR檢測的河流表層沉積物不同形態磷含量
4 結論與展望
1)從TP和Po的提取效率來看，BD和EDTA前處理能提高TP的提取效率，而且前提取液中TP的損失量較小.5種提取劑前處理Po的損失量差別不大，EDTA處理可以提高Po的提取量.綜合TP和Po來看，EDTA前處理既可以提高TP和Po的提取效率，又能保證TP和Po在前提取液中的損失量較小;核磁共振圖譜分析顯示，EDTA可以提高沉積物中正磷酸鹽、焦磷酸鹽、磷脂和DNA的含量.
2)不同的提取劑對順磁性離子Fe和Mn提取效率差異較大：與僅用NaOH提取相比，幾種提取劑前提取后對NaOH提取液中Fe離子的影響不顯著，但BD、EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取可以去除大量Fe離子，從而降低沉積物中Fe離子的含量;對Mn離子而言，EDTA和EDTA+Na2S2O4前提取可以降低沉積物中Mn離子含量，保證了NaOH提取液中Mn離子含量低于僅用NaOH提取.具體參見污水寶商城資料或http://m.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
3)綜合以上3個主要指標可以得到，對于總磷和有機磷含量均較高的河流沉積物樣品，在進行有機磷提取分析時，采用兩步提取方法，即首先利用50 mmol · L-1 EDTA進行前提取后利用0.25 mol · L-1 NaOH提取可以保證較理想的Po提取效率和核磁共振圖譜、較低的順磁性離子干擾，從而保證沉積物有機磷液相31P-NMR分析的科學性和有效性.
本研究基于河流沉積物樣品探究了5種常用提取劑的提取效果，取得了較為理想的結果.與目前使用范圍較廣的提取劑配比(0.25 mol · L-1 NaOH+50 mmol · L-1 EDTA)相比，本研究在探索不同提取劑提取機理和優選更適用的提取劑方面具有科學意義，而且作者利用本文優化的提取方法對海河流域其他河流進行有機磷提取分析，均取得了較好的效果(未發表數據).因此，本方法完全可以應用于高磷含量的河流沉積物有機磷分析.環境樣品理化性質千差萬別，要想獲得較為理想的提取劑必須針對不同環境樣品進行大量的實驗，以驗證提取劑和提取方法的普適性.目前，我國河湖富營養化問題突出，在對水-沉積物界面磷的生物地球化學循環過程及影響因素等問題上仍需深入探討，而核磁共振技術可以為此提供有力的技術支持.基于以上考慮，將來可以加大提取劑的選擇范圍和擴大環境樣品類型，以選擇理想的有機磷提取劑，優化有機磷提取方法體系.
